快速凝胶荧光染色法在尿液蛋白电泳分析中的应用

贾 佳， 潘 婕， 倪 军， 王 森， 徐志晔， 柏 兵

（南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，江苏 南京 210008）

尿蛋白变化通常是肾脏或其他脏器系统实质性损伤或功能性改变的反映。目前，在临床实验室中一般仅检测尿总蛋白水平[1]，但这不能反映出尿蛋白的选择性情况。实际上，在肾小球滤过增加、肾小管重吸收减少以及肾小球、肾小管损伤释放或主动分泌等条件下，尿蛋白都会升高，并且在尿蛋白成分上出现一定的特征性。因此，除尿蛋白水平外，其成分分析对病因判断具有重要意义。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）是蛋白成分分析的常用手段[2]，但由于考马斯亮蓝染色液在灵敏度上的局限性，制约了SDSPAGE在尿液样本蛋白分析中的应用。SYPRO Ruby是一种可与蛋白结合的荧光染料，用于凝胶染色时，具有很高的灵敏度及较广的线性范围[3]。本研究利用这种新型染料对SDS-PAGE后的尿蛋白样本进行染色，并作初步研究。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2018年10月南京大学医学院附属鼓楼医院37例肾脏疾病患者的尿液，其中男20例、女17例，年龄21～72岁。另收集同期南京大学医学院附属鼓楼医院8例系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者（SLE组，均为女性，年龄18～45岁）的尿液，与5名女性体检健康者（正常对照组）的尿液作对比。

1.2 方法

1.2.1 样本的收集和处理 留取所有对象的清洁中段尿。采用AU5800全自动生化分析仪（美国Beckman Coulter公司）检测尿液总蛋白水平，试剂盒购自南京厄尔尼医学科技有限公司。在尿液标本中加入4×LDS加样缓冲液（美国ThermoFisher Scientific公司）及10 mmol/L二硫苏糖醇（1，4-dithiothreitol，DTT）（美国Sigma-Aldrich公司），80 ℃加热10 min后，冰上静置1 min，20 000×g离心3 min。将1.3 g/L尿蛋白标准品（德国DiaSys Diagnostic Systems GmbH公司）用1×LDS加样缓冲液进行倍比稀释，按上述方法处理，上样量为10 μL，10个孔道中的最终蛋白加样量分别为5 000.0、2 500.0、1 250.0、625.0、312.5、156.0、78.0、39.0、20.0、10.0 ng。

1.2.2 凝胶准备与SDS-PAGE 取商品化蛋白质电泳预制胶（ExpressPlus PAGE Gel，4%～12%；南京金斯瑞生物技术公司），按说明书要求进行电泳。样本量较多时，自备增宽凝胶。

1.2.3 考马斯亮蓝染色液染色 参照考马斯亮蓝R250染色液（含10%乙酸、50%甲醇，美国Bio-Rad公司）说明书，将已进行过电泳的凝胶染色过夜，蒸馏水脱色至条带清晰，拍照保存。

1.2.4 常规凝胶荧光染色 将凝胶用去离子水清洗3～5次，用固定液（50%甲醇和7%醋酸）固定30 min，再用去离子水清洗3～5次，用SYPRO Ruby染色液（美国ThermoFisher Scientific公司）浸泡，轻轻摇动，室温下避光过夜。用10%甲醇与7%醋酸的混合液清洗3次，再用清水清洗3次，拍照保存，并将图像背景调为黑色，蛋白条带为灰色。

1.2.5 快速凝胶荧光染色 本研究参照SYPRO Ruby染色液说明书及文献[4]，对染色方法进行了改进。采用快速凝胶荧光染色法，染色时间缩短至15 min。具体步骤：电泳结束后，将用去离子水预洗后的凝胶放入预热至90 ℃的去离子水中清洗3次，然后放入预热至90 ℃的荧光染液中染色15 min，再用常温去离子水漂洗3遍，显像拍照，将蛋白条带结果与染色过夜的蛋白条带结果进行比较。

1.3 图像处理

采用Image J软件（美国国立卫生研究院）对凝胶上的蛋白条灰度进行定量。由于2种凝胶的条带颜色不同，其灰度值不能直接比较，所以分别以各自的第1个尿液样本的灰度为基准进行标准化。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。2种方法间的比较采用双因素方差分析和post-hoc Tukey检验。

2 结果

2.1 SYPRO Ruby染色液染色的灵敏度

尿蛋白标准品梯度稀释并进行SDS-PAGE后分别采用SYPRO Ruby染色液和考马斯亮蓝染色液进行染色。与考马斯亮蓝染色液染色结果相比，SYPRO Ruby染色液染色后的凝胶上可见更多清晰的蛋白条带。当尿蛋白标准品加样量为39.0 ng时，考马斯亮蓝染色液染色已无明显条带，见图1（a）。当尿蛋白标准品加样量为10 ng时，SYPRO Ruby染色液染色的主要蛋白（疑似白蛋白）条带依然可见，见图1（b）。

分别测定2种染色方法染色后的疑似白蛋白条带的灰度值并进行标准化。结果显示，SYPRO Ruby染色液染色后的疑似白蛋白条带灰度值高于考马斯亮蓝染色液染色，见图1（c）。

用1例慢性肾炎患者的尿液样本进行重复实验，结果与尿蛋白标准品一致，见图2。

图1 尿蛋白标准品SYPRO Ruby染色液染色与考马斯亮蓝染色的比较

图2 慢性肾炎患者尿液样本SYPRO Ruby染色与考马斯亮蓝染色液染色的比较

2.2 SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色在不同肾脏疾病患者尿液样本分析中的应用

对37例肾脏疾病患者的尿液样本进行SDSPAGE和SYPRO Ruby染色液染色。结果显示，不同肾脏疾病患者之间尿蛋白成分有明显的特征性变化，同种疾病患者尿蛋白成分不完全相同。见图3。

对总蛋白浓度无明显升高的SLE患者尿液标本进行SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色分析。SLE组尿液标本中大部分蛋白条带与对照组一致，但在相对分子质量100 000处出现了一根较浓的蛋白条带。见图4。

图3 不同肾脏疾病患者尿液样本的SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色分析

图4 SLE组与对照组尿液样本的SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色分析

2.3 快速凝胶荧光染色法与染色过夜的蛋白条带显色比较

将尿液总蛋白浓度正常的患者尿液样本分为2份，1份用快速凝胶荧光染色法进行15 min快速染色，1份染色过夜。与染色过夜的蛋白条带相比，快速凝胶荧光染色法显色较弱。见图5。

图5 快速凝胶荧光染色法与染色过夜的蛋白条带显色比较

3 讨论

本研究采用SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色对尿液蛋白成分进行分析，并以此为基础建立了快速凝胶荧光染色法，通过高温加热将染色时间缩短至15 min，这为快速凝胶荧光染色法在临床的常规开展提供了可能。本方法可检测到10 ng尿蛋白（加样量为10 μL），即可检测到1 ng/μL的尿液蛋白，可满足临床对尿液样本的检测要求。

本研究结果显示，相同肾脏疾病的不同患者之间的尿液蛋白成分不太一致，即使尿总蛋白浓度正常，其蛋白成分却可能已经发生了变化，说明尿蛋白成分可能与肾脏的病因关系较小，与肾脏损伤和功能状况有更为密切的关系，提示尿蛋白成分分析对肾脏损伤和功能变化具有重要价值。本研究结果显示，尿总蛋白正常的SLE组尿液标本中大部分蛋白条带与对照组一致，但在相对分子质量100 000处出现了一根较浓的蛋白条带。结合文献报道，推测该条带可能为尿调节素蛋白[5-6]。本方法不仅可以协助更好地判断蛋白尿的选择性，还可以发现更多异常出现的蛋白。

综上所述，以SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色为基础的快速凝胶荧光染色法在尿液蛋白分析中具有重要价值，可作为尿蛋白分析的常规方法，为疾病的诊治提供更多的信息。