新型冠状病毒肺炎诊断的相关实验室检测技术应用

杜晶辉， 李 莎， 刘 旭

（天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

2019 年12月发现于我国武汉的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）目前已成全球蔓延趋势，在COVID-19的诊治中，实验室检测起到了至关重要作用。在这一新发传染病的救治过程中，各医疗机构结合诊治实践，总结出COVID-19的重要实验室检验指标，并编制了临床路径[1-2]，包括确诊、鉴别诊断和辅助诊断3部分。目前，关于鉴别诊断检测技术的研究相对较少，确定诊断检测技术中病毒核酸检测是重要手段，血清抗体检测也可作为确诊指标。辅助诊断检测技术主要是在疾病治疗中发挥作用。我们对COVID-19的确定诊断、鉴别诊断和辅助诊断相关实验室检测技术进行概述。

1 COVID-19确定诊断实验室检测技术

1.1 病原学诊断

病原学诊断主要包括病毒的分离培养和核酸检测。病毒分离培养是实验室诊断病毒的“金标准”，但是由于该方法检测时间长（体外分离培养需要6 d）、生物安全等级要求高（P4实验室），因此在临床上的开展受到限制[3]。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）核酸检测方法较多，包括逆转录-聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）、等温核酸扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）技术、依赖核酸序列扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技术、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术、基于成簇的规律间隔的短回文重复序列/及其相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas）基因核酸检测技术、基因芯片技术、基因测序等。其中，实时荧光RT-PCR及基因测序为相关部门推荐的检测方法[4]。

1.1.1 实时荧光RT-PCR SARS-CoV-2的基因组为单链正RNA，需先通过反转录酶合成互补的cDNA链，再以cDNA链为基础进行PCR扩增[5]。截至2020年4月27日，我国国家药品监督管理局（the National Medical Products Administration，NMPA）共批准了19个SARS-CoV-2核酸检测试剂（表1）。荧光RT-PCR主要分为二重实时荧光RT-PCR和三重实时荧光RT-PCR（均为Taqman探针法）。二重检测的靶基因主要是RdRp基因[位于开放读码框1a/b（open reading frame 1ab，ORF1ab）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）]；三重检测的靶基因是RdRp基因、N基因和包膜蛋白（envelope protein，E）基因。有研究团队已经对6种不同品牌的试剂盒进行了比较，得出了部分试剂的准确性、灵敏度及重复性欠佳的结论[6]。

表1 NMPA批准的SARS-CoV-2核酸检测试剂（截至2020年4月27日）

实时荧光RT-PCR检测核酸的方法具有灵敏度高、特异性强、相对基因测序速度快、可批量化和成本低的优点，但相对血清抗体检测，其对实验场所及人员要求高、操作繁琐、耗时长，检测人员感染风险高，结果受样本质量、实验条件及人员操作等因素影响较大[7]，特别是假阴性问题，使核酸检测的作用一度被质疑。假阴性结果主要由样本质量、样本采集时间与病毒含量、样本的保存、运输和处理及试剂盒本身的局限性、检验操作等因素导致，已有许多研究针对这些因素提出了对策：（1）样本质量。下呼吸道样本（深部痰、肺泡灌洗液或支气管灌洗液等）较上呼吸道样本（鼻咽拭子）更易检出病毒，但COVID-19患者一般为干咳无痰，灌洗液样本采集难度大、危险系数高；采集下呼吸道样本一般可在插管的患者中进行，上呼吸道样本建议采集鼻拭子，或同时采集鼻拭子和咽拭子，放入同一个采集管中，采集拭子宜采用植绒拭子[8-9]。（2）样本采集时间与病毒含量。随着病程的进展，不同部位的病毒含量是不同的，因此不同病程应采用不同方法采集不同部位的样本[10]。（3）样本的保存、运输和处理。RNA病毒核酸稳定性较差，样本采集后应该尽快进行检测，24 h内检测可置于4 ℃保存，无法24 h内检测，应-70 ℃或以下保存。样本的运输应在4 ℃进行，运输容器应有病毒保存液[11]。（4）试剂盒本身的局限性。应急研发生产的试剂盒缺少完整的临床应用和方法学验证，实验室在使用不同批号试剂前应做相应的性能验证[6]。选择至少包含最为保守及特异的ORF1ab区域以及N基因的试剂盒[12]。（5）检验操作。磁珠法是较为常用的核酸提取方法，具有简便、高效、提取浓度及纯度较高等优点[11]，实验室应参加室间质评并做好室内质控，指派专业人员进行检测。针对核酸检测的假阴性问题，大多学者建议以血清抗体检测作为SARS-CoV-2核酸检测阴性疑似病例的补充检测，或在疑似病例确诊时与核酸检测协同应用[13]。结 果判读应结合各品牌试剂说明书（表2）。

表2 SARS-CoV-2的实时荧光PT-PCR检测结果判读

1.1.2 基因测序 基因测序可对样本中未知基因组序列进行全新测定和鉴定，以确认未知病原体基因组信息。我国学者利用二代测序的宏基因组学技术，于2020年1月7日从患者体内分离出SARS-CoV-2并进行了基因组测序，并于2020年1月12日向世界卫生组织上报了相关信息。基因测序技术可用于未知感染性疾病宏基因组学分析和传染病监控，快速应对新型传染性疾病的暴发，提高对疾病发生和传播的理解，并进行数据共享，指导核酸检测产品的设计等[14]。还可帮助了解病毒的遗传信息，对病毒进行追踪和溯源，为临床诊断及治疗提供科学依据，并为病原学、免疫学和流行病学研究奠定基础[15]。

基因测序技术的高敏感性、高准确性特点较适用于最初病毒的鉴定和后期病毒的进一步研究，以及对疑难病例的诊断与鉴别诊断[16]，但由于对实验室环境、设备和人员素质的要求较高（专业人员对序列的解读），且耗时长、成本高，不适合用于SARS-CoV-2的快速、大批量的常规检测[17]。

1.2 血清抗体检测

人体感染SARS-CoV-2后，病毒会作为抗原刺激人体免疫细胞产生抗体，因此可以通过检测人体内是否产生特异性的抗体来间接判断是否感染SARS-CoV-2。检测的抗体主要分为IgM和IgG 2类。IgM抗体是机体初次免疫应答产生的抗体，产生速度快，但浓度低、维持时间短、亲和力差，主要提示现阶段被感染的状态，可作为早期感染的指标；IgG抗体在感染晚期出现，浓度高、维持时间长、亲和力好，可提示既往感染。SARS-CoV-2进入人体后到产生IgM抗体约为1周时间，但目前暂无针对COVID-19的抗体检测窗口期及2次检测间隔时间的研究，因此何时进行第1次和第2次血清抗体检测，目前尚无共识。

抗体检测的样本主要是血清、血浆或全血，检测技术主要分为3类：化学发光法、胶体金免疫层析法和酶联免疫吸附试验。截至2020年4月27日，NMPA共批准11个SARS-CoV-2抗体检测试剂，其中胶体金法6个，化学发光法5个。目前，对COVID-19血清抗体检测的研究主要集中在胶体金免疫层析法，但是相关文件中提出需要进行IgG抗体4倍升高的检测[4]，我们认为只使用定性的胶体免疫层析法是不能完全满足要求的。

化学发光法灵敏度高、特异性强、检测范围宽，操作自动化高，检测速度快，但容易检测出低值的抗体量，假阳性偏高，且需要化学发光仪，成本较高。使用化学发光法测定IgM和IgG临床特异度可以高达96.20%和92.41%[18]。化学发光法测定总抗体优于胶体金免疫层析法，化学发光法检测IgM适用于疾病的各个阶段[19]。胶体金免疫层析法检测样本采集易标准化（全血样本）、操作简单、报告时间快（约15 min）[13]，适用于快速筛查，特异性较高，无需特殊设备（目视判定结果），有辅助诊断的价值[20]，然而其检测灵敏度和准确度相对化学发光法和酶联免疫吸附试验低，容易出现假阴性结果，建议与其他方法联用。酶联免疫吸附试验具有特异性强、灵敏度高（较胶体金免疫层析法）的特点，载体标准化难度较低，成本相对化学发光法低，但检测速度慢（1～2 h）、易污染、步骤较为繁琐，检测通量相对较小[21]，截至3月16日，尚无NMPA批准的试剂。ZHANG等[22]采用酶联免疫吸附试验试剂盒检测IgG和IgM，连续监测15例COVID-19患者IgG和IgM的滴度变化，发现采样第5天，IgG的阳性率（81%～100%）和IgM的阳性率（50%～81%）都大幅增加，这与核酸检测相对较低的阳性检出率（50%）相反。由于酶联免疫吸附试验的性能介于化学发光法和胶体金免疫层析法之间，但检测时间较长，在COVID-19诊断中未见优势，故相关研究较少。

核酸检测联合抗体检测结果判读见表3。

表3 SARS-CoV-2核酸检测联合血清抗体检测结果判读

抗体检测操作简单，对实验环境及人员要求较低，且仅需采集血液标本（相对核酸样本采集风险较低）。有研究结果表明，56 ℃ 30 min灭活处理血液样本对免疫层析法及化学发光免疫分析法（荧光免疫层析法除外）检测SARS-CoV-2抗体结果几乎无影响，因此可在检测前先进行灭活以降低检验人员感染风险[23]，可用于COVID-19的早期诊断、流行病学筛查和临床转归预测，是快速筛查和核酸辅助诊断的重要方法[13]。但样本溶血或红细胞、纤维蛋白未离心去除、细菌污染、患者自身抗体、嗜异性抗体引起假性非特异性反应会造成假阳性结果[24]。采用防腐剂、抗凝剂等处理样本，样本在冰箱中保存过久，试剂使用前未平衡至室温，用量不足，温育时间或温度不足，受到污染或失效（酶联免疫吸附试验），层析过快（胶体金免疫层析法）等，都会导致假阳性结果。单独使用SARS-CoV-2特异性IgM和IgG抗体在早期诊断与筛查COVID-19时存在较大的漏诊和一定的误诊风险，同时检测IgM、IgG抗体可以提高检测的准确性，减少漏诊[25]。有研究结果表明，血清学检测SARS-CoV-2阳性率比较高，将核酸检测和血清学检测结果综合分析，可能提高检出率[26]。

2 COVID-19鉴别诊断相关实验室检测技术

SARS-CoV-2感染所致COVID-19的临床特征与普通病毒性肺炎相似，需要与其他病原体引起的社区获得性肺炎进行鉴别诊断[27]，进行呼吸道病原体检测是将COVID-19与其他呼吸道病毒（流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒等）及肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌等引起的肺炎进行区分的必要措施。当患者在非疫区，且无明显流行病学接触史时，应酌情筛查上述病原体，排除这些病原体引起的肺炎，从而做到疾病的早期鉴别诊断[28]。

由于COVID-19疑似患者首先于发热门诊就诊，为更好地做到早发现、早隔离，在检测项目的选择上应该首先考虑胶体金技术、微流控芯片技术等快速、集成化、高通量的检测技术[29-30]。四川大学华西医院实验室推荐检测甲/乙型流感病毒抗原筛查、13种常见呼吸道病毒核酸检测、肺炎支原体抗体、肺炎衣原体抗体和呼吸道样本细菌培养等[2]。首都医科大学附属北京天坛医院张国军团队对出现流感样症状且经胸部影像学检查证实存在下呼吸道感染的发热门诊就诊患者进行胶体金甲/乙型流感病毒抗原抗体检测，从而快速与SARS-CoV-2感染患者进行鉴别诊断[31]。针对社区获得性肺炎常见的肺炎链球菌检测，有学者建议使用肺炎链球菌尿抗原检测的方法实现快速检测[32]。

在结果判读时，呼吸道病原体检测全部为阴性，临床表现具有病毒性肺炎特征，即使SARS-CoV-2核酸检测阴性，也应重新取阳性率更高的样本进行核酸检测，或结合血清学抗体检测进一步判读结果。对COVID-19确诊患者也应酌情增加呼吸道病原体检测，根据是否合并其他病原感染[17]来调整治疗方案。

3 辅助诊断相关实验诊断技术

辅助诊断相关的实验诊断技术包括血液炎性指标（血常规、C反应蛋白、降钙素原和血清淀粉样蛋白A等）、生化指标（肝功能、肾功能、心功能、血气分析等）、免疫指标（促炎细胞因子、趋化因子及淋巴细胞亚群）等。血液炎性指标可用于COVID-19的初步鉴别诊断，张国军团队确证了几类血常规标志物的鉴别属性，可以作为核酸检测的一个有效补充。但是SARS-CoV-2引起的感染较为复杂，单纯依靠血液炎性指标进行鉴别诊断较困难[31]。生化指标检测技术主要是通过器官功能检测判断和机体损伤情况，进而调整治疗方案，SARS-CoV-2与器官损伤具有一定相关性，对肝功能、肾功能等器官功能进行检测，可有效判断病情变化。但对患者进行肝、肾、心功能检测并不能判断SARS-CoV-2直接损伤组织器官的严重程度，应考虑治疗药物是否对这些组织器官造成了损伤。由于SARS-CoV-2主要侵害肺组织，因此血气分析对于COVID-19肺功能的监测尤为重要，可作为判断病情的标准之一[33]。针对COVID-19患者免疫反应进行监测，对促炎细胞因子、趋化因子等进行检测可为临床免疫干预提供更加准确的切入点，从而充分控制免疫失衡，更好地发挥人体免疫功能。已经有学者分析了中药在遏制COVID-19引起的免疫过激、细胞因子风暴及抗急性肺损伤中的潜在应用价值[34]。总而言之，辅助诊断相关检测技术可以为COVID-19的严重程度判断、治疗方案调整、预后情况判断、危险因素分析提供帮助，在疾病的诊治中，主要是在“治”中发挥重要作用。

4 总结

COVID-19需要与常见的社区获得性肺炎进行鉴别诊断，针对这些社区获得性肺炎病原体的检测方法已经较为成熟，包括核酸、抗原抗体等检测技术。采取何种检测方法，除考虑其本身的性能外，还需要考虑鉴别诊断的检测速度与生物安全。我们认为，由于COVID-19具有潜伏期长、可无症状传播等特点，对其进行鉴别诊断有更高的要求，因此在发热门诊中除采用快速、准确的检测方法，如多联检测的胶体金方法外，更需要充分结合流行病史、临床表现、影像学表现等综合考虑。

COVID-19确定诊断中，核酸检测具有多种优势，但是其主要问题是易受采样、运输、试剂质量及检测技术等因素的影响出现假阴性结果。有学者认为呼吸道样本检出率为肺组织＞支气管肺泡灌洗液＞抽吸痰或鼻咽吸取物＞鼻咽拭子或口咽拭子＞鼻拭子[35]，但我们认为样本取材部位应该结合患者临床情况及病程进行分析，如患者临床表现为明显的病毒血症，建议采集乙二胺四乙酸抗凝全血进行核酸检测，如病程尚在感染前期，尚未发展到病毒性肺炎，肺泡灌洗液样本的检出率未必高于鼻咽拭子，或者同步采集鼻咽拭子，以提高检测的阳性率。由于SARS-CoV-2核酸检测试剂为应急审批，性能验证可能尚不完善，应对比多家试剂，并进行性能验证，各地临床检验中心应组织开展SARSCoV-2核酸检测的实验室间比对。COVID-19的治疗还处于探索阶段，各种抗病毒药物（如抗人类免疫缺陷病毒药物）的使用，对核酸检测结果可能也有影响。

血清抗体检测技术具有快速、简便、操作性强等优点，对于其抗原抗体交叉反应等引起的假阳性问题，可在结果判读时结合患者临床表现尽量避免，COVID-19血清抗体检测主要的问题应该是窗口期的假阴性问题，即何时进行血清抗体检测，何时进行第2次检测，判断4倍升高是亟需解决的问题，其IgM抗体、IgG抗体产生时间是否与其他病毒类似，目前也尚无有效方法加以判断。

COVID-19明确诊断后，需要根据疾病严重程度选择不同的治疗方案，在疾病的治疗过程中需要对组织脏器进行功能监测，从而不断调整治疗方案，治疗过程中需要对疾病的风险因素进行评估，对患者预后进行判断。整个治疗过程中都需要辅助诊断检测技术给予帮助。

综上所述，不同的实验室检测技术各有利弊，在COVID-19诊断中应该联合使用，取长补短，同时应该综合考虑患者的流行病学特征、病程、病史、用药情况、临床表现、影像学表现等，早发现、早治疗。