VEGF siRNA 联合凉血通络方治疗脉络膜新生血管的实验研究

王维琦 ，彭华，马珊，杨金润，张昆，代自超，杨荣强，陈蕊，方雨葳

脉络膜新生血管 (choroidal neovascularization，CNV)经常发生在眼底黄斑区，是多种眼部疾病如年龄相关性黄斑变性、特发性CNV、高度近视脉络膜黄斑出血等眼底病共有的病理改变，可导致患者严重和不可逆的视力损伤[1-4]。CNV 发病机制十分复杂，尚未阐明。目前认为，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 是引起CNV 的重要因素之一，组织过度释放的VEGF 参与CNV 发生、发展过程，因此抗血管内皮生长因子成为目前抑制CNV 的研究重点。通过玻璃体腔注射带有目的基因的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）可高效、特异性地抑制CNV 中的VEGF 表达[5-6]。但CNV中有多因素致病、多因子参与，以抑制单一因子为目标的治疗手段，难以达到满意效果。目前越来越多的研究者尝试各种疗法的有机结合，使疗效得到巩固和提高。凉血通络方为复方光明胶囊组方加减化裁而来，具有活血化瘀，软坚散结，通络明目等多种功效，在临床上治疗CNV 类眼病取得良好的效果[7]。本研究旨在研究凉血通络方联合VEGF siRNA治疗CNV 类眼病的效果并探讨其作用机制，为治疗CNV 类眼病提供一种新的手段和科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物

健康8～10 周清洁级棕色BN 大鼠90 只（购于北京维通利华实验动物技术公司），雌雄不限，体重180～220 g。实验前裂隙灯检查双眼前节和眼底检查均正常。动物及实验适用条约符合国家科学技术委员会发布的《实验动物管理条例》。动物合格证书编号为：SCXK（京）2011-0011

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1 仪器 氪激光机（美国Coherent 公司）、眼底血管造影仪（德国海德堡公司）、PCR 仪（德国Thermal）、切片机（美国Leica 公司）。

1.2.2 主要试剂 复方托吡卡胺滴眼液(北京双鹤现代医药技术有限责任公司，4%盐酸奥布卡因滴眼液(日本参天制药株式会社)，荧光素钠注射液(Alcon Laboratories，Inc.美国)；兔源性VEGF 多克隆抗体(Proteintech)；兔 源 性PEDF多克隆抗体(Abcam)；HRP标记的羊抗兔多克隆抗体（Abmart）；RNAiso plus Total RNA 提取试剂（宝生物工程大连有限公司），Takara 逆转录试剂盒（宝生物工程大连有限公司），HR EvaGreen qPCR Master Mix 试剂盒（上海辉睿生物科技有限公司）。

1.3 药物

凉血通络方由龙血竭、滇重楼、土鳖虫、鸡血藤、密蒙花、紫草、川芎等组成，参考《药理实验方法学》[8]，用量与浓度按有色鼠与人用药量比进行换算（MechRubner 公式），配制临床等效剂量浓度1.0 g/L生药，由云南省中医医院制剂中心加工成水提液，袋装密封备用。

siRNA 由广州锐博生物科技有限公司设计并合成。根据基因库中大鼠VEGF 基因的三段mRNA 序列设计化学合成3 对VEGFsiRNA：GCGGATCAAACCTCACCAA、GCCAGCACATAGGAGAGAT、GCCTGGTATGAGGACCTGC。

1.4 方法

1.4.1 CNV 动物模型的建立BN 大鼠，腹腔内注射10%水合氯醛（0.1 ml/100 g）麻醉后，右眼滴复方托吡卡胺滴眼液散瞳10 min，盐酸奥布卡因表面麻醉，应用激光光凝仪在裂隙灯显微镜下，距视盘2 PD 位置围绕视盘在2 支视网膜血管之间光凝1 个点，每眼共光凝8 个点。光凝参数为：波长532 nm，激光功率250 mW，光凝斑直径50 μm，光凝时间0.05 s。光凝成功的判断：有气泡扩大并回缩，提示Bruch’s 膜被击破。

1.4.2 分组90 只BN 大鼠，随机分为3 组：空白对照组、VEGF siRNA 组、联合治疗组。各组动物按前述方法右眼激光光凝建立CNV 模型。

1.4.3 给药方法 空白对照组：光凝后不予任何处理；VEGF siRNA 组：从光凝后第1 d 开始至光凝后13 d，每隔1 d 给予VEGF siRNA 5 μl（0.3 nmol/ul）玻璃体腔内注射，方法：大鼠角巩缘后1 mm 处垂直球心进针,至玻腔内可以见到针头时停，推注5 μl 药物进入玻璃体腔内。保持注射器针头于玻璃体腔内10s防止回流，缓慢拔除针头，注射结束。联合治疗组：从光凝后第1 d 开始至光凝后13 d，每隔1 d 给予VEGF siRNA 5 μl（0.3 nmol/ul ）玻璃体腔内注射；同时给予凉血通络方中药灌胃，每只2 ml，每日1 次。

1.5 观察指标

1.5.1 眼底荧光素血管造影（FFA）检查 于光凝后14 d，随机选取各组大鼠10 只，行眼底荧光素血管造影检查，腹腔注射10%的水合氯醛（1 ml/100 g)麻醉，腹腔注射10%荧光素钠注射液（0.1 ml/100 g），注射完成立即采用眼底照相机进行同步动态造影观察照相。

1.5.2 组织病理学 光凝后14 d，各组在完成FFA 检查后6 h，待大鼠体内荧光素染料排净，经过量麻醉处死，立即摘除眼球，置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中，室温过夜。常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，行4 μm连续切片并常规HE 染色。取连续切片中CNV 区域内视网膜至色素上皮层最大距离为CNV 中央厚度。

1.5.3 蛋白印记检测 观察脉络膜VEGF、色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor,PEDF）蛋白表达。光凝后14 d，各组随机选取10 只BN 大鼠，显微镜下去除眼前节，剥离去除视网膜组织，迅速置于蛋白裂解液中提取蛋白，-80℃保存。将50 μg的蛋白样品加样到配置好的SDS-PAGE 凝胶蛋白电泳，电泳后转到PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h；TBS 液漂洗；加入VEGF 抗体（1:1000）、PEDF 抗体（1:1500）、β-actin 抗体（1:5000），4℃过夜，TBS 液漂洗，HRP 标记的羊抗兔多克隆抗体（1:5000）室温孵育1 h，TBS 液漂洗，曝光显色。应用图像分析软件Image J 分析蛋白表达情况。

1.5.4 实时荧光定量PCR 检测 观察脉络膜VEGF及PEDF mRNA 表达水平。光凝后14 d，各组随机选取10 只BN 大鼠，显微镜下去除眼前节，将视网膜剥离去除，获取脉络膜-巩膜复合体标本。利用RNAiso plus Total RNA 提取试剂提取RNA，Takara逆转录试剂盒反转为cDNA，采用QuantStudio 3 型实时荧光定量PCR 检测系统进行实时定量PCR，HR EvaGreen qPCR Master Mix 试剂盒，按照说明书使用。引物序列：VEGF（上游：TATCTTCAAGCCGTCCTGTG；下游：TTGACCCTTTCCCTTTCCTC）；PEDF（上游：CCGAGAACTGAAGACTATCC；下游：GTGTCCCTCAGAACAAAGA），以GAPDH 为内参。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行统计分析，计量资料结果采用均数±标准差（±s）表示，比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间的两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组荧光素渗漏面积比较

图1 光凝后14 d 各组FFA 检查荧光素渗漏情况。1A 空白对照组；1B VEGF siRNA 组；1C 联 合 用药组；1D 各组FFA荧光素渗漏面积比较条图。* 与空白对照组比较，P＜0.05；△与VEGF siRNA组比较，P＜0.05

光凝后14 d，空白对照组可见较大的荧光素渗漏面积，而VEGF siRNA 组及联合组荧光素渗漏面积较小，与空白对照组比较差异具有统计学意义(VEGF siRNA 组t=2.627,P=0.014，联合用药组t=5.361,P=0.000)，且联合治疗组荧光素渗漏面积小于VEGF siRNA 组，差异具有统计学意义(t=2.733,P=0.011)（图1）。

2.2 各组CNV 中央厚度比较

光凝后14 d，空白对照组CNV 中央厚度较厚，VEGF siRNA 组及联合用药组CNV 中央厚度较薄，VEGF siRNA 组与空白对照组CNV 中央厚度比较差异具有统计学意义(t=2.312,P=0.013)，联合用药组与空白对照组CNV 中央厚度比较差异具有统计学意义(t=5.147,P=0.000)，且联合用药组CNV 中央厚度低于VEGFsiRNA 组，差异具有统计学意义（t=2.372,P=0.020），与FFA 检查趋势一致（图2）。

2.3 脉络膜VEGF 蛋白及PEDF 蛋白表达变化

光凝后14 d，VEGF siRNA 组、联合用药组VEGF 蛋白表达较空白对照组表达下调，差异均有统计学意义(VEGF siRNA 组t=2.495,P=0.019，联合用药组t=5.242,P=0.000)，联合用药组VEGF 蛋白表达低于VEGF siRNA 组，差异有统计学意义(t=2.747,P=0.011)。光凝后14 d，VEGF siRNA 组PEDF 表达程度与空白对照组比较无明显差异(t=-1.847,P=0.076)，联合用药组PEDF 蛋白表达程度较空白对照组增强，差异有统计学差异(t=-11.11,P=0.000)（图3A、3B）。

2.4 脉络膜VEGFmRNA 及PEDFmRNA的表达变化

光凝后14 d，VEGF siRNA组、联合用药组VEGF 蛋白表达较空白对照组表达下调，差异均有统计学意义(VEGF siRNA 组t=2.795,P=0.009，联合用药组t=5.934,P=0.000)，联合用药组VEGF mRNA表达低于VEGF siRNA 组，差异有统计学意义(t=3.139,P=0.004)。光凝后14 d，VEGF siRNA 组PEDF mRNA表达程度与对空白照组比较无明显差异(t=0.015,P=0.998)，联合用药组PEDF mRNA 表达程度较空白对照组增强，差异有统计学意义(t=-17.263,P=0.000)，与蛋白印记检测趋势一致（图3C）。

3 讨论

VEGF 是血管新生的主要诱导因子,其表达上调能促进血管内皮细胞增殖、分裂、迁移及基底膜和细胞外基质的降解,增加血管的通透性,在CNV 发病过程中有十分重要的作用[9-10]，因此抑制VEGF 表达成为治疗CNV 重要靶点之一[11]。

siRNA 是一种有效的基因干扰策略，siRNA 的早期干预可能通过影响VEGF 的表达而抑制CNV的生长[5]。本研究采用激光光凝建立大鼠CNV 模型，于光凝后第1 d 开始至第13 d，每隔1 d 给予VEGF siRNA 玻璃体腔内注射，至第14 d，经FFA 检查及HE 染色观察，结果显示RNA 干扰组眼底荧光素渗漏面积及CNV 中央最大厚度均较空白对照组减小，VEGF 蛋白表达及mRNA 水平均较空白对照组降低，提示VEGF siRNA 对CNV 有明显的抑制作用，与文献报道一致[12]。

图2 光凝后14 d 各组CNV 光镜图片(HE×200)。2A 空白对照组；2B VEGFsiRNA 组；2C 联合用药组；2D 光凝后14 d 各组CNV厚度比较条图。*与空白对照组比较，P＜0.05；△与VEGF siRNA 组比较，P＜0.05

图3 各组脉络膜VEGF、PEDF 蛋白电泳图及表达量比较。3A 光凝后14 d 各组脉络膜VEGF、PEDF 蛋白电泳图，1 空白对照组；2干扰组；3 联合用药组；3B 光凝后14 d 各组脉络膜VEGF、PEDF 蛋白相对表达量比较；3C 光凝后14 d VEGF、PEDF mRNA相对表达量比较。*与空白对照组比较，P＜0.05；△与VEGFsiRNA 组比较，P＜0.05

由于体内核酸酶的存在，siRNA 在细胞内迅速被降解，只能短暂的抑制新生血管进程从而导致新生血管复发，需反复注射。随着玻璃体腔内注射的次数增加，可能会导致眼内感染、眼压升高、青光眼、视网膜脱离等诸多并发症。基因转染虽然可提高抑制效果，但病毒的免疫原性和潜在突变的危险性限制了其临床应用[13]。目前CNV 类眼底病病机尚未十分明确，针对单分子来控制血管新生的治疗手段虽然显示出一定抑制作用，不能从根本上解决CNV 的发生及其复发问题。而多种疗法的有机结合，可协同产生更有效的阻止血管渗漏和抑制新生血管的形成的作用。

凉血通络方为复方光明胶囊组方加减化裁而来，组方中含龙血竭、滇重楼、鸡血藤等云南道地药材：龙血竭性温平，味甘咸，入心肝肾三经，具有活血化瘀，驱腐生肌、止血敛疮、软坚散结等作用，被誉为“活血圣药”，具有双向调控作用，为君药；土鳖虫性咸寒，有小毒，入肝肾经，具有破血逐瘀，通经止痛功效；滇重楼性微寒，味苦，归肝经，清热解毒，与土鳖虫共为臣药，加强破血逐瘀之效；鸡血藤苦甘温，归肝肾经，功用补血，化瘀，通络，被称为“血分之圣药”；密蒙花味甘，性微寒，归肝胆经，清热养肝，明目退翳；紫草性寒，味甘咸，归心肝经，功效凉血活血，与鸡血藤、密蒙花共为佐药；川芎性辛温，归肝胆、心包经，功用行气开郁化瘀，被誉为“血中之气药”，为使药。全方共奏凉血化瘀，软坚散结，退血翳通络明目功效，在临床上治疗CNV 类眼病取得良好的效果[7]。

本文研究结果显示，在行玻璃体腔注射VEGF siRNA 治疗的基础上，再加用凉血通络方能有效减小眼底荧光渗漏面积、CNV 厚度，能有效抑制脉络膜新生血管生长，疗效高于RNA 干扰组。进一步研究显示，两者联合应用，不仅可以降低VEGF 蛋白表达及VEGF mRNA 水平，还可增加PEDF 的蛋白表达及mRNA 水平。PEDF 属丝氨酸蛋白酶抑制因子，是已知的最强的内源性血管抑制因子，可通过促进活化的血管内皮细胞凋亡从而引起新生血管的退化，抑制新生血管形成，PEDF 也可通过调节其他因子如VEGF、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）的表达抑制血管增生[14]。

西医治疗有其不足，而中医学博大精深，辨病与辨证相结合，内外兼治，从络脉理论认识其病因病机，以络脉“热、瘀”立论，行凉血通络治疗，与RNA干扰技术联合应用，2 种疗法的有机结合，通过多个治疗靶点共同作用，有可能弥补单一疗法的不足，使疗效得到巩固和提高。

综上所述，VEGF siRNA 干扰联合凉血通络方应用对于激光诱导的CNV 有明显抑制作用，能更有效的阻止血管渗漏和抑制新生血管的形成的作用，为CNV 的治疗提供了新思路。