五味子乙素通过诱导血红素加氧酶1 表达改善糖尿病大鼠的视网膜病变

王开玲，周海艳

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）属于糖尿病最常见的微血管并发症，也是导致眼盲的主要原因之一[1]。DR 病人出现视力减退、甚至失明，严重影响患者的正常生活质量。视网膜组织过度的炎性反应及氧化损伤是DR 的重要病症，也是引起细胞凋亡、神经功能减退的关键因素[2-3]。血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）活性对热较稳定，具有抗炎症、抗凋亡、舒张血管等生物活性，研究报道HO-1 在较多疾病中发挥保护性作用，如降低肾脏组织HO-1 表达会引起肾脏血流灌注减少，进一步恶化肾脏的损伤，然而高表达HO-1 可以改善肾脏损伤[4]。蔡晶晶等[5]发现DR 患者外周血单个核细胞中HO-1 mRNA 水平显著低于正常人群，提示HO-1 也许可以作为保护性指标介导DR 的发生发展。中医药在防控糖尿病视网膜病变方面有一定保护作用[6]。五味子乙素（schisandrin B，SchB）是从五味子中提取分离得到的木质素类天然活性化合物，具有显著的抗氧化、抗炎症及抗细胞凋亡的作用，它可以通过抑制细胞内炎性通路活化达到对心脏、大脑、肝脏及肾脏等组织的保护作用[6-8]。目前，SchB 对DR大鼠的保护作用及其对HO-1 蛋白的相关作用不明确，基于此，本文探讨了SchB 对DR 大鼠视网膜功能及HO-1 蛋白表达的影响，以期为DR 早期治疗提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 动物

7 周 龄200～250 g 雄性SPF 级SD 大鼠32只（辽宁长生生物技术有限公司，合格证SCXK2010-0012），分笼饲养于屏障环境中。

1.2 药物及试剂

五味子乙素（山东绿叶制药，批号：H2011051108，纯度≥98%），链脲佐菌素、锌原卟啉购自美国Sigma 公司，缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)试剂盒（南京建成公司，批号：L140915427)，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）试剂盒（南京建成公司，批号：L140912517），血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang Ⅱ) 试剂盒（南京建成公司，批号：L141824517），细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）试剂盒（武汉华美公司，批号：H2018031406），一氧化氮（NO）试剂盒（武汉华美公司，批号：H2018041157），肿瘤坏死因子-α（tumor Necrosis Factor，TNF-α）试剂盒（武汉华美公司，批号：H2017110629），丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒（武汉华美公司，批号：H2017120850），超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase1，SOD1）试剂盒（武汉尤尔生，批号：L140915390），过氧化氢酶(catalase，CAT) 试剂盒（武汉尤尔生，批号：L140914218），HO-1 及β-actin 单克隆抗体购自英国Abcam 公司。

1.3 仪器 倒置显微镜（日本Nikon 公司，型号：NIB400）；酶标仪（瑞士THERMO 公司，型号：Multiskan FC）；凝胶成像系统（上海嘉鹏生物科技公司，型号：ZF-258）。

1.4 方法

1.4.1 DR 模型构建 大鼠适应环境1 周后，采用尾静脉注射链脲佐菌素构建DR 模型，3 d 后检测大鼠血糖浓度，其中血糖浓度≥16.65 mmol/L 的大鼠作为实验组。

1.4.2 分组 将大鼠分为正常对照组、DR 组、DR+SchB 组及DR+SchB+锌原卟啉组。正常对照组为未经链脲佐菌素处理的SD 大鼠8 只，给予生理盐水灌胃处理56 d；DR 组 为DR 模型鼠8 只，给予静脉注射链脲佐菌素处理3 d；DR+SchB 组为DR 模型鼠8 只，给予静脉注射链脲佐菌素处理3 d 和SchB 灌胃（30 mg/kg）56 d；DR+SchB+锌原卟啉组为DR 模型鼠8 只，给予静脉注射链脲佐菌素处理3 d、SchB 灌胃（30 mg/kg）56 d和锌原卟啉（10 μmol/kg）56 d。

1.4.3 观察指标 大鼠灌胃8 周后，采用适量的10%水合氯醛麻醉大鼠后，每只采血3 ml，静置于冰上2 h 后3000 r/min 离心5 min，吸去血清转移至无菌eppendorf 管内超低温保存。采用颈椎脱臼法处理大鼠，摘除双侧眼球分离视网膜，制备成匀浆放置4℃、13 000 g 离心15 min，吸取蛋白上清至新eppendorf管中，保存在-80 ℃冰箱。分别检测血清HIF-1α、VEGF 及ANGⅡ水平，同时检测视网膜组织匀浆ICAM-1、TNF-α、NO 及MDA 水平，还分析了匀浆中SOD1 和CAT 酶活性。操作步骤：加入待测样品加入包被反应孔中，置于37 ℃孵育1 h，然后洗涤3 次；然后加入新配的酶标抗体，37 ℃孵育1 h，拍板洗涤5次；再加入HRP 标记二抗，37 ℃孵育1 h，拍板洗涤5次；最后加入终止液反应5 min，然后在酶标仪中测定OD 值。

1.4.4 Western Blot 实验 采用BCA 试剂盒测定匀浆中蛋白浓度，加入适量上样缓冲液混匀，100 ℃煮沸7 min。用12%的SDS-PAGE 凝胶块电泳分离蛋白，完成后转膜。切割不同分子量目的蛋白条带至对应HO-1 及β-actin 一抗溶液中（稀释比均为1：3000），4 ℃震荡过夜，采用HRP 标记的二抗（稀释比1:1000）37 ℃孵育1 h，TBST 洗膜3 次后加入ECL 显影液，采用X 光胶片曝光。

1.5 统计学方法

采用SPSS20.0 统计学软件处理数据，计量资料结果采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SchB 对DR 大鼠血清中血糖及新生血管相关指标的影响

SchB 对DR 大鼠新生血管相关指标（HIF-1α、VEGF 及ANGⅡ）水平的影响（表1），提示DR 组大鼠HIF-1α（t=3.439，P=0.016）、VEGF（t=6.092，P=0.006）及ANGⅡ（t=9.026，P=0.002）水平高于正常对照组；新生血管治疗后会明显降低HIF-1α（t=5.109，P=0.009）、VEGF（t=3.286，P=0.019）及ANGⅡ（t=7.309，P=0.007）水平，但是SchB 与锌原卟啉共同治疗对DR 大鼠HIF-1α、VEGF 及ANGⅡ水平均无影响。实验结果还发现SchB 与锌原卟啉治疗后对大鼠血糖浓度也无明显降低，但是药物干预组血糖有下降趋势。

表1 SchB 对DR 大鼠血清中血糖及新生血管相关指标的影响（±s，n=8）

表1 SchB 对DR 大鼠血清中血糖及新生血管相关指标的影响（±s，n=8）

注：*与正常对照组比较，P＜0.05；#与DR 组比较，P＜0.05。HIF-1α：缺氧诱导因子1α；VEGF：血管内皮生长因子；ANGⅡ：血管紧张素Ⅱ

2.2 SchB 对DR 大鼠视网膜组织炎症因子水平的影响

SchB 对DR 大鼠视网膜组织炎症相关指标（ICAM-1、NO 及TNF-α）水平的影响如表2 所示，提示DR 组大鼠视网膜组织ICAM-1（t=10.043，P=0.000）、NO（t=8.328，P=0.003）及TNF-α（t=10.192，P=0.000）水平均高于正常对照组（P＜0.05）；SchB 治疗后会明显降低ICAM-1（t=4.573，P=0.015）、NO（t=7.649，P=0.004）及TNF-α（t=5.937，P=0.009）水平，但是SchB 与锌原卟啉共同治疗对DR 大鼠ICAM-1、NO 及TNF-α 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 SchB 对DR 大鼠视网膜组织氧化应激产物的影响

SchB 对DR 大鼠视网膜组织氧化应激相关指标（MDA、SOD1 及CAT）的影响如表3 所示，提示DR 组大鼠视网膜组织MDA 水平相对于正常对照组升高（t=4.219，P=0.017），而SOD1（t=5.313，P=0.007）及CAT（t=12.331，P=0.000）活性降低，有统计学意义（P＜0.05）；SchB 治疗后会降低MDA 水平（t=4.315，P=0.008）、升高SOD1（t=6.312，P=0.002）及CAT（t=11.094，P=0.000）活性，但是SchB 与锌原卟啉共同治疗对DR 大鼠MDA 水平、SOD1 及CAT活性差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 SchB 对DR 大鼠视网膜组织炎症因子水平的影响（±s，n=8）

表2 SchB 对DR 大鼠视网膜组织炎症因子水平的影响（±s，n=8）

注：* 与正常对照组比较，P＜0.05；# 与DR 组比较，P＜0.05。ICAM-1：人细胞间粘附分子1；NO：一氧化氮；TNF-α：肿瘤坏死因子-α

表3 SchB 对DR 大鼠视网膜组织氧化应激产物的影响（±s，n=8）

表3 SchB 对DR 大鼠视网膜组织氧化应激产物的影响（±s，n=8）

注：* 与正常对照组比较，P＜0.05；# 与DR 组比较，P＜0.05。MDA：丙二醛；SOD1：超氧化物歧化酶1；CAT：过氧化氢酶

2.4 SchB 对DR 大鼠视网膜组织HO-1 表达的影响

SchB 对DR 大鼠视网膜组织HO-1 表达水平的影响（图1）所示，提示DR 组大鼠HO-1 表达水平低于正常对照组（t=4.336，P=0.008）；五味子乙素治疗后会明显诱导HO-1 表达上调（t=6.113，P=0.006），差异有统计学意义。但是SchB 与锌原卟啉共同治疗对DR 大鼠视网膜组织HO-1 表达，与DR组比较，无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 SchB 对DR 大鼠视网膜血管密度的影响

图1 SchB 对DR 大鼠视网膜组织HO-1 表达的影响。1A HO-1 表达的电泳图；1B 4 组HO-1 表 达的条图。* 与正常对照组比较，P＜0.05；# 与DR组比较，P＜0.05。HO-1：血红素加氧酶1

DR 组大鼠视网膜血管增生，排列紊乱，毛细血管面积密度增高，与对照组比较差异有统计学意义（t=8.047，P=0.003）；五味子乙素治疗组大鼠视网膜毛细血管的分布较为均匀，血管增生不明显，与模型组比较，毛细血管面积密度下降，差异有统计学意义（t=3.094，P=0.012）；但是SchB 与锌原卟啉共同治疗对DR 大鼠视网膜血管密度无明显影响（图2）。

图2 SchB 对DR 大鼠视网膜血管密度的影响。2A 正常对照组；2B DR 组；2C DR+SchB 组；2D DR+SchB+锌原卟啉组

3 讨论

糖尿病是最常见的内分泌代谢紊乱性疾病，然而DR 为糖尿病较为常见的并发症之一，最后导致患者视力减退、甚至失明，会给患者及家庭带来极大的影响[9]。到目前为止，DR 的发病机制仍处于研究阶段，并未得到明确阐述，于是临床上探索防治DR的有效药物一直是研究热点。

VEGF 对血管新生具有较强的诱导作用，并且在DR 发生发展中发挥着重要的生物学效应，参与DR 形成的多个环节。生理条件低水平VEGF 能保证血管的稳定性及视网膜正常生长，当血糖水平升高时会导致VEGF 产生增高，进一步诱发视网膜血管渗漏、内皮细胞增殖形成新的血管[10]。在DR 发病初期，视网膜微血管处于缺血缺氧条件下，高糖及缺氧刺激HIF-1α 的活化，后者进一步促使VEGF 基因的高表达，促进DR 病情恶化[11]。VEGF 会诱导各种细胞因子的释放，其中ANGⅡ能够作用与血管内皮细胞，促使血管的形成。临床研究也发现VEGF 与ANGⅡ与DR 患者并且相关性较好[12]，并且中药葛根素还能通过抑制VEGF 基因表达改善DR 病情[13]。本研究发现，DR 大鼠血清中HIF-1α、VEGF 及ANGⅡ水平显著升高，SchB 治疗后可明显降低大鼠血清中HIF-1α、VEGF 及ANGⅡ水平，提示SchB可以抑制新生血管的形成，从而改善视网膜病变程度。

氧化应激及炎性反应也是DR 发生发展的重要因素，机体氧化稳态失衡及炎性因子大量产生可能是引起糖尿病患者并发视网膜病变的关键原因。糖尿病引起的代谢紊乱会进一步诱导自由基的大量升高，氧化应激产物会活化多元醇、蛋白激酶C 途径及己糖胺途径，引起新生血管的形成，还能活化炎性通路[14]。临床研究也发现DR 患者体内氧化应激产物MDA 水平明显升高，而抗氧化酶SOD 活性却明显降低；然而葛根素治疗后能明显降低视网膜组织氧化应激产物的水平，提升抗氧化酶活性，降低氧化损伤，改善DR 病情[15-16]。SchB 具有抗氧化及抗炎症的药理活性，本研究也发现SchB 治疗后能够明显降低DR 大鼠视网膜组织炎性因子ICAM-1、NO、TNF-α 及氧化应激产物MDA 水平，并且诱导抗氧化酶SOD1 及CAT 活性的增强。而HO-1 具有抗炎症、抗氧化、舒张血管等生物活性，因此诱导其高表达能够改善DR 大鼠的视网膜病变。早期研究提示早期糖尿病小鼠，视网膜组织中HO-1 表达增加，但到了疾病发展的后期HO-1 表达水平降低，引起抗氧化能力下降[17]。早期已证实DR 分为增殖前期和增殖期，在DR 各个阶段选用不同治疗方案，才可能获得最佳治疗效果。谢林英等[18]研究发现对糖尿病DR 患者开展早期视网膜光凝术，尽管对视野有一定损害，但仍能提高或保持其视功能；然而对增殖期患者采用此方案进行治疗时，临床疗效较差，并且对视野的损伤程度更为严重。本实验是在构建DR 模型鼠时同时给予SchB 治疗，属于DR 增殖前期阶段的治疗；然而，SchB 是否对DR 增殖阶段的治疗有效或带来负向影响需进一步研究。本实验发现DR组大鼠视网膜组织中HO-1 呈低表达，而经过SchB治疗后可诱导HO-1 表达；然而这种作用可以被HO-1 抑制剂锌原卟啉逆转，说明SchB 对DR 大鼠的早期保护作用可能主要通过上调HO-1 表达抑制新生血管形成、炎性反应及氧化损伤。