Foxp3-mRNA表达特征与慢性阻塞性肺疾病患者Th1/Th2免疫应答的调控作用分析

杜莉 陈亮 卓越 王碧玉

1海南省第三人民医院呼吸科,三亚572000;2海南省第三人民医院检验科,三亚572000

COPD是一种以不完全可逆的气流受限为特点的进展性疾病,在我国该疾病的流行特征主要与遗传与环境有关,而前者由于许多具体机制尚未明确因而成为近些年的研究热点[1-2]。有文献曾报道Foxp3-mRNA及其编码蛋白可特异性作用于Th细胞,该细胞在固有免疫和适应性免疫过程中均发挥重要作用,并可产生多种细胞因子(如IL),参与受感染细胞溶酶体酶(如酸性磷酸酶)的激活等分子事件[3-5];而Th细胞又可具体分为Th1和Th2 2种,Th1细胞参与迟发性超敏性炎症反应以及各类细胞免疫过程,Th2则可辅助B细胞分化为抗体分泌细胞,对体液免疫应答具有重要调控意义[6-7]。基于此本研究将针对Foxp3-mRNA表达特征与COPD患者Th1/Th2免疫应答的调控作用进行研究,为COPD患者机体免疫状态的监测及其相关机制提供理论基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究采用定群抽样的方法选取2016年3月至2017年12月海南省第三人民医院呼吸科接诊并在该院接受后续治疗的COPD患者作为本研究的受试对象,在对受试者进行研究目的说明后对其进行标本取材(取患者空腹静脉血10 ml,3 000 r/min离心(离心半径16 cm)取上清,等量分装为4份于-20℃低温环境下保存以供不同检测所需)。COPD的判定标准如下:用支气管扩张剂后,第1秒用力呼气容积占预计值百分比(forced expiratory volume in one second as a percentage of expected value,FEV1%pred)<80%及FEV1/FVC<70%;同时参考肺活量、潮气量等指标进行进一步确证。同时参照临床流行病学中病例对照研究的设计选取等额数量的对照。在向所有受试者说明研究目的并征得其同意后,受试者均签订患者知情同意书,研究符合 《赫尔辛基宣言》的原则。本研究共获得符合要求的观察对象180例,其中病例组95例,对照组85例,符合病例数∶对照数约为1∶1且对照数不少于病例数的设计原则。

1.2 实验方法

1.2.1 Foxp3-mRNA表达特征分析 用20μl TE缓冲液溶解后采用PCR法检测标本中Foxp3-mRNA的存在。PCR反应具体条件:根据NCBI中Genbank库的相关基因序列生物信息学数据设计引物,由上海其明生物有限公司合成。上游引物序列为:5'-GTTCAGGTAGCGATGAGCTAGCAAC-3',下游引物序列为:5'-CTGCATGCAGTGAGCAGAGAGCGTC-3',引物长度592 bp,反应温度:95℃60 s,55℃30 s,75℃60 s,持续40个循环后于75℃条件下延伸10 min。

扩增产物采用Western blot法进行蛋白产物的定性和定量分析。具体步骤:(1)将电泳后的凝胶从玻璃板上剥脱下来,置于煮胶盒,加入25%乙醇至乙醇浸过凝胶面为止。将煮胶盒放入微波炉,高温煮沸2.5 min,重复该步骤3次;(2)加入考马斯亮蓝染色液(至染色液浸过凝胶面为止)浸泡凝胶,放室温摇床缓慢振荡,均匀染色30 min至凝胶上的条带清晰可见;(3)用dd H2O漂洗已染色的凝胶后,加入5%的醋酸与25%乙醇混合液,脱色摇床缓慢摇动1 h左右至染色液基本洗脱为止;(4)脱色完毕后,将凝胶用dd H2O冲洗,置于凝胶图像扫描分析仪上观察结果,经图像软件处理后拍照保存。

1.2.2 Th1/Th2免疫应答系统表达测定 Th1/Th2免疫应答系统表达测定的指标包括干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)、IL-2、IL-4、IL-10,均采用酶联免疫吸附测定法(生产商:武汉优尔生生物制剂有限公司,编号:SEC173Ra、SEC229Ra、SEC231Ra、SEC237Ra,物 种:Rattus norvegicus,实验方法:双抗夹心法),结果于不同光波长(基本分布于可见光区)下进行检测(血清IFN-γ对应最大吸收光波长为369 nm、血清IL-2对应最大吸收光波长为378 nm、血清IL-4对应最大吸收光波长为373 nm、血清IL-10对应最大吸收光波长为378 nm),以吸光度值反应待测样品的浓度,若样品中吸光度值超过标准曲线上限时需对原样本进行稀释后重新测定,所得结果乘以稀释倍数得到最终结果。

1.3 统计学分析 采用描述性统计学指标(均数、标准差、中位数、四分位间距、极差、率、构成比、相对比等)对研究结果中的一般资料进行统计学描述;对服从正态分布的计量资料采用两独立样本t检验或单因素方差分析进行组间资料的比较,对不服从正态分布的计量资料采用2组或多组资料的秩和检验进行组间资料的比较;采用χ2检验进行率的比较;依据数据是否服从二元正态分别采用Pearson或Spearman法进行相关分析;无特殊说明情况下显著性水平α=0.05,所有P值表示双侧概率。

2 结果

2.1 受试者一般情况及肺部病变情况 本研究按照1.1述及的入选标准共纳入180例有效观察者。患者年龄(56.29±17.27)岁,年龄范围为39～75岁,其中男122例(67.78%),有肺部慢性炎症史的患者73例(40.56%),吸烟年限>20年的患者92例(51.11%),居住于PM2.5常年超标区域超过10年的患者88例(48.89%)。为控制混杂偏倚,事先对所有患者的基线资料进行匹配,结果显示患者基线资料的分布在不同的干预组之间差异无统计学意义(P值均>0.05),达到匹配效果。见表1。

在COPD病例组95例中出现慢性咳嗽的患者93例(97.89%),出现咳痰的患者78例(82.11%),出现气短或呼吸困难的患者64例(67.37%),出现喘息和胸闷的患者52例(54.74%),出现疲乏、消瘦的患者48例(50.53%)。

2.2 受试者Th1/Th2免疫应答系统表达测定指标对比分析 由于Th1/Th2免疫应答系统表达测定指标(细胞因子水平)原始数据基本服从正态分布(Shapiro-Wilk检验,W=0.996,P>0.05),故采用对结果进行描述,并通过两独立样本t检验对结果进行比较。结果显示,COPD病例组的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平均高于对照组且差异均有统计学意义(t=7.282、5.996、7.380、4.835,P值均<0.05)。不同年龄患者的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平差异均有统计学意义(F=22.237、16.943、45.386、31.831,P值 均<0.05)。不同吸烟年限患者的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平差异均有统计学意义(F=33.226、30.096、29.353、34.300,P值 均<0.05)。见表2～5和图1。

2.3 Foxp3-mRNA表达特征Western blot结果采用PCR法扩增Foxp3-mRNA片段,并采用Western blot检测受试者血清中Foxp3-mRNA表达特征。结果显示病例组在592 bp左右位置处可见清晰条带(组1-5),而对照组(组6)及DNA marker组(组7)基本无条带,表明Foxp3-mRNA在COPD患者中发生特异性表达的理论依据成立。见图2。

表1 病例组及对照组基线资料的分布情况(例)

表2 病例组及对照组受试者Th1/Th2免疫应答系统表达测定指标比较()

表2 病例组及对照组受试者Th1/Th2免疫应答系统表达测定指标比较()

组别 例数 干扰素γ(ng/L) IL-2(pg/L) IL-4(ng/L) IL-10(ng/L)病例组 95 4 154.71±261.62 369.83±56.56 94.40±22.32 58.82±20.39对照组 85 1 066.14±12.82 217.29±41.97 45.34±15.65 34.20±13.42 t值 7.282 5.996 7.380 4.835 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表3 不同性别受试者Th1/Th2免疫应答系统表达测定指标比较()

表3 不同性别受试者Th1/Th2免疫应答系统表达测定指标比较()

性别 例数 干扰素γ(ng/L) IL-2(pg/L) IL-4(ng/L) IL-10(ng/L)男性 122 4 112.79±226.85 374.86±38.39 91.44±27.34 56.76±20.88女性 58 4 206.11±284.93 364.78±18.49 97.94±19.50 60.27±16.95 t值 -1.035 0.936 -1.342 -0.988 P值 0.467 0.503 0.335 0.490

表4 不同年龄受试者Th1/Th2免疫应答系统表达测定指标比较()

表4 不同年龄受试者Th1/Th2免疫应答系统表达测定指标比较()

年龄 例数 干扰素γ(ng/L) IL-2(pg/L) IL-4(ng/L) IL-10(ng/L)<50岁 48 3 892.31±253.37 312.15±74.93 59.45±16.48 47.74±22.71 50～60岁 85 4 072.81±362.55 366.96±81.84 94.31±26.46 56.98±19.59>60岁 47 4 188.76±239.46 404.44±63.15 117.32±24.39 68.37±27.39 F值 22.237 16.943 45.386 31.831 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表5 不同吸烟年限受试者Th1/Th2免疫应答系统表达测定指标比较()

表5 不同吸烟年限受试者Th1/Th2免疫应答系统表达测定指标比较()

吸烟年限 例数 干扰素γ(ng/L) IL-2(pg/L) IL-4(ng/L) IL-10(ng/L)<10年 32 3 832.31±316.43 304.56±74.93 64.42±12.80 45.64±14.99 10～20年 56 4 101.82±326.35 362.10±62.94 91.77±26.79 59.64±19.32>20年 92 4 196.35±221.90 411.48±55.90 112.34±28.38 66.67±20.21 F值 33.226 30.096 29.353 34.300 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

图1 外周血中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10因子的流式鉴定图

2.4 Foxp3-mRNA表达特征与Th1/Th2免疫应答系统表达特征的相关性 采用Pearson积差相关对病例组Foxp3-mRNA表达特征与Th1/Th2免疫应答系统表达特征的相关性进行分析。结果显示,Foxp3-mRNA表 达 与IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平均呈正相关性且相关系数均具有统计学意义(r=0.614、0.493、0.529、0.501,P值均<0.05)。

图2 Foxp3-mRNA表达特征蛋白质印迹法结果

3 讨论

本研究结果显示Foxp3-mRNA在COPD患者中发生特异性表达的理论依据成立,该结论也得到部分国内相关研究[2-3,8-10]的理论依据的支持。mRNA作为近年来生物化学与分子生物学领域的研究热点,其研究重点意义在于,mRNA在核糖体上作为蛋白质直接合成的模板,决定肽链上的氨基酸排列顺序,因此从某种程度上说与DNA相比mRNA更加直接的决定了蛋白质合成过程。据相关研究[11-13]报道Foxp3基因本身参与ATP磷酸化反应,与适应性免疫应答以及血管再生有关,同时参与脂质和糖类物质代谢、血管发育、蛋白磷酸化的负调控过程,因此从分子免疫的角度上的确存在其与Th1/Th2免疫应答系统表达相关的可能性,而本研究的结论当中Foxp3-mRNA表达与IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平均呈正相关且相关系数均具有统计学意义,佐证了上述观点。

此外,Th细胞的分化方向主要取决于三方面,第一是抗原的性质,第二是局部环境中的激素,第三是细胞因子[14-17]。其中,诱导向Th1细胞分化主要与病毒和胞内寄生虫感染有关,而诱导向Th2细胞分化则主要与变应原(诱导产生变态反应的抗原)有关[4]。从我国的COPD总体流行病学特征[9-11]来看,环境因素相对于遗传因素对病因的贡献比例总体更大,但本研究中重点关注的Foxp3-mRNA则是一个遗传性质的因素,从病因分析的角度出发,多因多果及基因共表达网络模式的诞生充分说明交互效应的病因分析环境的影响,即COPD的环境流行病学因素可能影响患者的Foxp3-mRNA表达特征,同时也可能影响Th1/Th2免疫应答特征,而这种效应的存在可能会形成一种虚假关联(即Foxp3-mRNA表达特征与Th1/Th2免疫应答特征的正相关性并非分子层面的直接调控,而是受到某种环境因素的共同影响)。因此后续需要对这种可能性进行进一步分析,进一步验证Foxp3-mRNA表达特征与Th1/Th2免疫应答特征在机制层面的联系。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突