新老窖池黄水的差异性及静置培养对其影响

张会敏，孟雅静，王艳丽，李安军，刘国英，袁志强，张 严，邢新会

（1.安徽省固态发酵工程技术研究中心，安徽 亳州 236820；2.清华大学化工系，北京 100084）

中国浓香型白酒发酵是重要的微生物发酵研究领域，老窖池窖泥丰富的菌群对提高白酒发酵质量具有重要作用。目前，很多研究着眼于不同窖龄的窖泥菌群组成差异[1-4]。已知，随着窖龄增加，窖泥菌群丰度增加，窖泥逐渐老熟。窖泥的老熟本质上是窖泥菌群的老熟，窖泥菌群老熟过程中，受酒醅菌群的影响，即“万年糟”的作用。Wang Xueshan等[5]发现酒醅中的厌氧菌主要来自窖泥，即酒醅菌群也受窖泥菌群的影响。窖泥菌群和酒醅菌群具有相互影响的关系，黄水对维系两个固体菌群的相互关系具有重要作用。黄水又称黄浆水，是白酒发酵过程中原材料经微生物分解代谢形成的游离水，其与各种有机物和微生物一起沉降于窖池底部。黄水被认为含有窖池发酵过程中驯化的所有微生物菌种[6]，一方面，黄水对窖泥的影响类似于降雨/灌溉对土壤的影响，黄水菌群随黄水渗入窖泥，对窖泥菌群产生影响；另一方面，窖泥菌群中带有鞭毛的厌氧菌随黄水游弋到酒醅中影响酒醅菌群，如梭菌、瘤菌等。因黄水又被称为“液体窖泥”，是“万年糟”作用的执行者。

目前，黄水菌群的研究方法有传统的纯化培养方法、非培养的聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）方法和磷脂分析法[7-9]。韩永胜等[10]通过纯培养方法发现，随着窖龄增加，黄水的总酸、总酯等有机物含量和微生物数量有增加趋势。王传荣等[11]进一步通过纯化培养方法发现黄水中的优势菌群为乳酸菌、丁酸菌和己酸菌。李可等[7]通过纯培养并构建克隆文库的方法发现黄水中的优势菌群为梭菌属、乳酸菌属和沙雷氏菌属，并检测到了甲烷菌的存在。Li Hui等[8]通过非培养的PCR-DGGE方法，发现黄水中的菌群组成主要有乳酸杆菌（Lactobacillus）、梭菌属（Clostridium）和沉积菌属（Sedimentibacter）。外，醋酸杆菌属（A c e t o b a c t e r）、蛋白杆菌属（Proteiniphilum）、喜热菌属（Caloramator）和甲烷菌也在黄水中检测到[8-9]。而目前传统培养方法得到的结果为可以培养的菌属，PCR-DGGE方法也不能给出菌属的具体定量结果。因，基于自然界中未知菌/未培养菌占多数的情况[12]，需要相对更准确的免培养方法全面解析黄水中的菌群组成。已知Clostridium、Sedimentibacter、Proteiniphilum和Caloramator是老窖泥中常见的厌氧菌属，而甲烷菌的存在被认为是浓香型窖泥老熟的标志[13]。 可知，黄水菌群中含有老窖泥中典型的厌氧菌。与黄水相比，窖泥给菌群提供了一个相对封闭、稳定、厌氧的生存环境。已知窖泥菌多数为厌氧菌[4]，因，黄水菌群中的厌氧菌有可能对窖泥菌群的老熟起重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土壤DNA提取试剂盒（D5625） 美国Omega Bio公司；AP-GX-50凝胶回收试剂盒 美国Axygen 公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

1.3 方法

2018年10月，选取两组窖龄不同而发酵工艺相同的新老窖池，发酵结束时抽取黄水本。取6 个新窖池（窖龄6 a）新鲜黄水本，标记为YN-1～YN-6；6 个老窖池（窖龄≥50 a）新鲜黄水本，标记为YO-1～YO-6。另外取3 个老窖池黄水本封闭静置培养5 个月，标记为YO5-1～YO5-3；另外取3 个新窖池黄水本封闭静置培养5 个月，标记为YN5-1～YN5-3。以上18 个黄水本用于提取基因组后高通量测序。

1.3.2 理化性质分析

采用紫外分光光度计法检测铵态氮含量；采用酸碱中和法测定酸度；采用标准葡萄糖液反滴定法检测淀粉和还原糖含量[14]；采用GB 11893ü 1989《水质 总磷的测定》钼酸铵分光光度法检测黄水中的总磷。

KH2PO4（0.02 mol/L），柱流速0.1 mL/min，检测波长208 nm，柱箱温度30 ℃。

1.3.3 DNA提取与Illumina高通量测序

1.3.4 测序数据处理与统计学分析

首先将原始序列优化得到用于后续分析的优质序列。即：去掉长度小于150 bp或者大于300 bp、模糊碱基数大于1、同聚碱基数目大于8、引物错配大于1 bp的序列（QIIME，v1.8.0）；双向拼接（FLASH软件v1.2.7）序列，剔除嵌合体（USEARCH，v5.2.236）序列。UCLUST聚类（97%相似度）优质序列得到各可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），认定各OTU中丰度最高的序列为其代表序列。在80%可信度水平，使用Silva数据库（Release132）注释各代表序列即为代表OTU的注释结果，并形成OTU列表。去除OTU列表中序列数目少于总测序量0.001%的OTU。然后将OTU列表进行100 次抽平，取平均，对取平均后的序列数进行四舍五入取整，得到新的OTU列表。对抽平取后的OTU列表，使用Qiime软件（v1.8.0）计其Shannon指数、Chao 1指数等微生物群落多性指数。使用Qiime软件，对Weighted UniFrac距离矩阵分别进行UPGMA聚类分析，并使用R软件（R3.3.2）进行可视化。黄水本理化因子之间的差异显著性分析通过SPSS（24.0）方差分析（ANOVA）实现。黄水理化因子与其菌群组成之间的冗余分析（redundancy analysis，RDA）通过Canoco 5实现。

2 结果与分析

2.1 黄水本的理化性质

新老窖池的新鲜黄水相比较，两者的淀粉、还原糖、丙酸、乳酸、乙醇含量不具有显著性差异，说明新老窖池发酵粮食（淀粉）产生乙醇的主体过程无差异。如表1所示，与新窖池的新鲜黄水相比，老窖池的新鲜黄水中，丁酸、己酸、戊酸、乙酸、铵态氮的值偏高，而酸度略低。说明：1）与新窖池相比，老窖池发酵过程中代谢形成的各种酸等风味物质较丰富，可能与老窖池发酵过程中己酸菌与甲烷菌之间存在良性的氢传递，更容易促进己酸和丁酸等风味物质的合成有关[15]； 2）老窖池发酵过程中，铵态氮含量比较高，可能与老窖池中降解氨基酸的菌含量比较高有关，比如胺杆菌属（Aminobacterium）；3）老窖池的新鲜黄水酸度略低，一方面与其中铵态氮含量较高有关，另一方面与乳酸含量略低（尽管两者不具有显著性差异）有关，因为几种有机酸中，乳酸的含量最大，且其pKa值最小，其对酸度的贡献最大。

表 1 4 组黄水样本的理化性质Table 1 Physicochemical properties of 4 groups of HS samples

新老窖池黄水经过5 个月的封闭静置培养后，丙酸、乳酸值无显著变化，淀粉、还原糖、酸度值不同程度地降低，而铵态氮有所增加。说明静置培养过程黄水中的菌群生长消耗了其中的淀粉、还原糖，同时生成了铵态氮（降解氨基酸的菌），如Aminobacterium[16-18]。最终黄水酸度有所下降。新老窖池黄水培养后的不同之处在于：老窖池黄水经培养后，己酸和戊酸的值显著降低；新窖池黄水培养后乙醇含量显著降低，丁酸和乙酸的值显著增加。目前已知，在窖泥中存在以乙醇[19-20]和乳酸[21]为前体生成丁酸/己酸的菌种。新窖池黄水经过封闭静置培养后，乙醇减少，同时丁酸和乙酸增加，很可能与其中存在以乙醇为前体的丁酸/己酸菌的代谢功能有关。相比较而言，老窖池黄水中的丁酸/己酸菌在封闭静置培养期间似乎并不活跃。

2.2 黄水原核微生物群落的α多性

通过Illumina MiSeq高通量测序，得到673 738 条平均长度为207 bp的优质序列，平均30 182～53 152 条/本。对所有本10 次抽平（subsample）取平均四舍五入后，得到序列26 931～26 981 条/本，进行后续分析。OTU聚类（97%相似度）得到4 886 个OTU，平均77～580 个/本。每个本的测序覆盖率大于99%，说明测序数目足够，测序序列可以代表其菌群组成。得到注释（门、纲、目、科、属）的序列大于99.9%，无法得到注释的序列仅12 条序列，说明对窖泥中大量的未培养菌也充分实现了系统分类。如表2所示，新老窖池的新鲜黄水相比较，两者微生物群落的OTU数目、Shannon指数和Chao 1指数都不具有显著性差异，经过封闭静置培养5 个月后，3 个微生物群落参数值均显著升高，说明静置培养后黄水中的菌群丰度和多性增加。

表 2 4 组黄水样本的细菌群落丰度和多样性参数Table 2 Bacterial community richness and diversity indices of 4 groups of HS samples

2.3 黄水原核微生物群落的β多性

图 1 4 组黄水样本中15 个优势门的相对丰度Fig. 1 Relative abundances of the 15 dominant phyla in 4 groups of HS samples

对OTU注释，总共得到35 个门，其中32 个细菌门，3 个古菌门。在门的水平上，在新老窖池新鲜黄水中，厚壁菌门（Firmicutes）为绝对优势菌门，分别占新老窖池新鲜黄水本的98.46%和95.72%。将相对丰度超过0.1%的门定义为优势菌门（图1）。除Firmicutes外，其余4 个优势菌门在新老窖池新鲜黄水中的相对丰度依次为：变形菌门（Proteobacteria，1.0%和2.0%）、放线菌（Actinobacteria，0.11%和1.0%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，0.1%和0.36%）和绿弯菌门（Chloroflexi，0.03%和0.45%）。Firmicutes在黄水中的绝对优势情况也存在于窖泥中[1-2]，但在黄水中占的比例更大。

经过封闭静置培养5 个月后，新老窖池的黄水中的菌群组成发生变化。新老窖池黄水中Firmicutes的相对丰度分别下降为63.14%和79.59%；Proteobacteria在两者中的丰度分别大幅上升至20.86%和12.88%；Bacteroidetes则分别上升至6.21%和1.74%；Actinobacteria分别上升至0.63%和2.79%；Chloroflexi分别上升至1.32%和0.47%。外，经过静置培养后，互养菌门（Synergistetes）在老窖池黄水中的相对丰度上升幅度很大（由0.06%变为2.11%），而在新窖池黄水中变化幅度相对较小（由0.02%变为0.46%）。通过静置培养，黄水菌群与窖泥菌群中的组成更接近了，比如Firmicutes与窖泥中的菌群组成更接近。

图 2 4 组黄水样本中8 个优势属的相对丰度Fig. 2 Relative abundances of the 8 dominant genera in 4 groups of HS

图 3 18 个黄水样本菌群Weighted Unifrac Distance聚类图Fig. 3 Cluster analysis of the 18 HS samples based on Weighted Unifrac Distance

对O T U 注释，共得到6 6 4 个属，注释度为97.81%，其余序列只能不同程度地注释到门、纲、目、科等级别。注释度之所以如高，因为黄水本中的属种非常集中，Lactobacillus占绝对优势。除Lactobacillus，黄水本中相对丰度超过1%的优势菌属还有：不动杆菌属（Acinetobacter）、双歧黄色高温菌属（Thermoflavimicrobium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、产己酸菌属（Caproiciproducens）和Aminobacterium（图2）。

图 4 4 组黄水样本中8 个优势菌属的相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of the 8 dominant genera in 4 groups of HS samples

深入分析黄水中优势菌属在封闭静置培养前后的变化（图4）可知，经过封闭静置培养后，新老窖池黄水本中的绝对优势菌属Lactobacillus的相对丰度分别降低至52.5%和68.55%。推测很可能与封闭静置培养条件下的缺氧环境不利于兼性厌氧菌Lactobacillus的增殖有一定关系。外，黄水中的其余7 个优势菌属的相对丰度都显著性增加。

除上述提到的Caproiciproducens和Aminobacterium，窖泥中还存在很多功能菌[1,3]， 如棒状杆菌（Caldicoprobacter）[31]、贪铜菌属（Cupriavidus）[32]、 甲烷囊菌属（M e t h a n o c u l l e u s）[2]、瘤梭菌（Ruminiclostridium）[33]、Sedimentibacter[2]和互营单胞菌属（Syntrophomonas）[2]，其对窖泥的老熟具有很重要的作用。图5为这些菌属在4 组黄水中的相对丰度。经过封闭静置培养后，6 株菌在新老窖池黄水中的相对丰度都有不同程度的升高。与新窖池黄水相比，老窖池黄水经过封闭静置培养Methanoculleus、Sedimentibacter、Syntrophomonas的相对丰度增加更多。说明黄水中含有大量促进窖泥老熟的菌种，且黄水可以提供这些菌种在厌氧条件下生长所需要的营养物质。

图 5 6 个窖泥中的优势菌属在4 组黄水样本中的相对丰度Fig. 5 Relative abundance of 6 PM-dominant genera in 4 groups of HS samples

2.4 黄水本理化性质与菌群之间的RDA

图 6 黄水的理化因子与其菌群之间的RDAFig. 6 Redundancy analysis of the physicochemical factors and HS prokaryotic communities

如图6所示，2 个主成分的总解释度为87.49%，但是两个坐标轴上的解释度相差悬殊，主要集中在RDA1（86.16%）。以横轴为分界点，封闭静置培养前的新鲜黄水本集中在左侧，静置培养后的黄水本散布在右侧。由也可得知，与窖池的窖龄相比，是否静置培养对黄水本的菌群组成影响更大，与图3结论一致。图6中还原糖、淀粉、酸度和乙醇与新鲜黄水本菌群呈强烈正相关，铵态氮与静置培养黄水呈正相关，表明新鲜黄水中还原糖、淀粉、酸度和乙醇的值偏高，静置培养后的黄水铵态氮升高。使用互动向前选择程序验收11 个理化因子，发现参数还原糖的解释度最高65%（P＜0.01）。外，其余理化指标的贡献率都不具有显著性，指标（解释度）分别为：己酸（6.2%）、乳酸（5.9%）、铵态氮（2.7%）、乙酸（2.2%）、丁酸（1.7%）、酸度（1.4%）、淀粉（1.2%）、乙醇（0.9%）、戊酸（0.3%）、丙酸（0.2%）。

3 讨 论

新老窖池新鲜黄水中淀粉、还原糖、丙酸、乳酸、乙醇的含量不具有显著性差异。与新窖池相比，老窖池新鲜黄水中，即老窖池酒醅发酵过程中产生的丁酸、己酸、戊酸、乙酸等风味物质含量较丰富，同时产生的铵态氮的含量较高。己酸是生成浓香型白酒特色风味物质己酸乙酯的前体物质，与“窖池越老，酒质越好”的结论一致。铵态氮是菌群生长的氮源，老窖池黄水中铵态氮含量高与老窖池中菌群含量更丰富有关系。

本研究通过高通量测序分析黄水中的原核菌群组成，证明静置培养有利于窖泥老熟菌属的增加，尤其是老黄水中，窖泥老熟菌属的增加更明显，比如Aminobacterium相对丰度从0.47%升到1.97%，已知优质老窖泥中Aminobacterium相对丰度显著高于新窖泥[4]。Methanoculleus相对丰度从接近于0%上升到0.24%，已知新窖泥中的Methanoculleus相对丰度为0.16%，25 a窖龄窖泥中的相对丰度上升到1.56%[2]。静置培养后的老黄水中Methanoculleus的相对丰度尽管没有达到老窖泥中的丰度，但说明黄水中天然有促进窖泥老熟的菌种存在，为将来通过自然培养黄水改良窖泥提供了一种思路。而考虑到黄水环境与窖泥环境的差异，需要进一步摸索适宜黄水中窖泥老熟菌种生存繁殖的条件。实现对黄水的自然培养并应用于促进窖泥老熟的养护，不但有利于促进窖泥老熟，对黄水的处理也有重要意义。因为黄水的化学需氧量值很高，排放会远超过国家允许的废水排放指标[34]。目前，有研究直接将黄水蒸馏制成低度黄 水酒[35]，但只是将黄水中的乙醇进行回收利用；有研究通过超临界CO2萃取技术从黄水中提取风味物质[36]，但成本太高。外，柴玉强等[37]提出将黄水进行次发酵再蒸馏酒的方法。本研究尝试了直接静置厌氧培养黄水的方法，可能解决黄水的处理问题，将黄水变废为宝，用于窖泥改良，将来还需要对黄水作为“液体窖泥”的培养条件进行进一步研究。