CYP1B1基因多态性对前列腺癌根治术后生化复发（BCR）预测价值的初步研究

顾成元 秦晓健 戴波 朱耀 朱煜 许 华 叶定伟

（复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科-复旦大学上海医学院肿瘤学系 上海 200032）

目前前列腺癌根治术是临床局限性前列腺癌的标准治疗方法，但10年内术后复发率高达30%［1］。前列腺特异抗原（prostate specific antigen，PSA）和病理指标对于术后复发的预测特异度和敏感度较低［2］，临床亟需能够预测术后复发的生物标记物，理想的生物标志物将有助于对患者复发风险分层进行精准辅助治疗从而改善预后。

研究显示雌激素通过氧化代谢在前列腺癌的进展过程中起重要作用［3］。CYP1B1是一种在雌激素代谢羟基化过程中的关键酶。雌激素（如雌激素酮E1、雌二醇E2）可经氧化代谢生成儿茶酚雌激素和雌激素醌，而CYP1B1催化儿茶酚雌激素生成致癌性4-OHE。这些氧化代谢产物具有DNA损伤效应，导致前列腺癌发生及持续进展。CYP1B1蛋白表达量在前列腺癌组织中明显高于良性前列腺增生组织［4］。

由于CYP1B1在雌激素代谢过程中的重要作用，CYP1B1基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）有可能通过改变基因表达水平影响前列腺癌进展。目前尚无CYP1B1基因多态性与前列腺癌根治术后复发的关联性研究。本研究旨在探索CYP1B1基因多态性对于前列腺癌根治术后生化复发的相关性，评估其预测价值。

资料和方法

研究对象纳入2006年至2009年间在复旦大学附属肿瘤医院接受前列腺癌根治术的426例局限性前列腺癌患者，中位随访时间37.7个月，术后每3个月随访PSA变化。将术后血清PSA水平连续两次超过0.2 ng/mL定义为生化复发（biochemical recurrence，BCR）。临床病理资料和随访信息通过电子病历系统检索获得。排除术后接受辅助内分泌或放疗的患者。

候选SNP选择及基因分型检测利用人类基因组数据库NCBI，查找CYP1B1基因，确定研究区域。通过HapMap数据库查找本研究区域的SNP位点基因分型数据信息，获取汉族人群中CYP1B1基因及其延伸区域内所有SNP位点基因分型数据。将获取的基因分型数据导入Haploview 4.2软件，筛选出最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）＞0.05的SNPs，导出连锁不平衡图谱及数据。通过对连锁不平衡图谱的数据比对，挑选出每个单倍域内r2≥0.8且LOD＞3的SNPs，选取平均r2值最大的一个SNP作为该单倍域标签SNP。共确定8个标签SNP位点（rs10916、rs162562、rs2551188、rs9341266、rs9341248、rs162549、rs1056827、rs1056836）。

基因分型检测方法如文献所述［5］。外周血样本来自复旦大学附属肿瘤医院组织库，采用德国Qiagen公司试剂盒，按照操作步骤提取全基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量，BioPhotometer核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf公司）检测DNA的浓度和纯度，定量标化至50 ng/μL，于4 ℃下分装备用。采用TaqMan探针法进行基因分型，即利用Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活力对探针本身进行酶切，Taqman探针的两端分别标记有荧光基团和对应的淬灭基团。设计引物和探针定制于美国ABI公司。CYP1B1 rs1056836的引物序列F（5'-3'）：TGTCAACCAGTGGTCTGTGAATC，R：（5'-3'）TGGATCAAAGTTCTCCGGGTTA。探针序列（5'-3'）：ATGA-CCCAC/GTGAAGTG。反应体系5 μL，包括1 μL DNA模板、0.125 μL引物探针、2.5 μL TaqMan Universal Master Mix以及1.375 μL去离 子水。在每 个384孔反应板中设置阴性空白对照。扩增条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。扩增之后用ABI PRISM 7900HT荧光定量PCR仪检测荧光分布情况，并应用SDS 2.4软件进行基因分型。随机抽取10%的样本进行重复试验和验证，基因型符合率为100%。

CYP1B1 mRNA检测上述426例病例中，127例保存了前列腺癌旁组织样本。按照Trizol试剂（美国Invitrogen公司）的说明提取总RNA。PCR反应体系总体积20 μL，其中模板cDNA 1 μg，10×PCR缓冲液（15 mmol/L MgCl2）2.4 μL，Taq-DNA聚合酶1U，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，5 mmol/L上游引物和下游引物各l μL，加ddH2O至20 μL。依次预变性、变性、退火、延伸。扩增产物为GAPDH，452 bp；CYP1B1，297 bp。引物CYP1B1上游（5'-3'）：GCTGCAGTGGCTGCTCCT；下游（5'-3'）：CCCACGACCTGATCCAATTCT。

统计学方法计量资料以表示，数值变量用非配对的t检验，分类变量用χ2检验。组间基因型频率及等位基因频率比较采用χ2检验。采用Cox比例风险回归模型，对可能的混杂因素（年龄、PSA、Gleason评分等）进行调整，计算风险比（hazard ratio，HR）和95% 可信区间（95% confidence interval，95%CI）来评估各种基因型与前列腺癌术后复发风险的相关性。采用Kaplan-Meier法在显性遗传模式下进行无复发生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。所有统计分析使用SAS 9.1软件完成。

结 果

患者基线特征见表1。共426例患者，中位随访时间为37.7个月，其中100例术后出现生化复发（23.5%）。全组患者1年无生化复发率为94.1%，3年无生化复发率为78.6%，其中57例接受内分泌治疗，43例接受挽救性放疗联合内分泌治疗。术前血清PSA、病理分期、淋巴结侵犯、Gleason评分与生化复发相关（P＜0.01）。

表1 研究对象的临床病理特征Tab 1 Clinicopathologic characteristics of thestudy populations ［n（%）］

426例患者基因型分布见表2，对上述临床病理特征进行调整后分析显示，8个标签SNP位点中发现CYP1B1 rs1056836与前列腺癌根治术后生化复发相关（CG基因型，HR：0.65，95%CI：0.33～0.93，P=0.025），而其余7个SNP位点与前列腺癌根治术后生化复发之间无关联性，所以CYP1B1 rs1056836是独立预后因素。

在显性模型中，受突变基因影响并表现出性状的定义为暴露组，即暴露于遗传因素——rs1056836多态性中突变型G。因为是显性模型，所以CG和GG都表现出突变性状，CC为野生性状。根据定义，CG/GG为暴露组，CC为非暴露组。本研究将CYP1B1 rs1056836中CC型与CG/GG型携带者两者相比，CC基因型携带者术后进展至生化复发时间较短，两组间差异具有统计学意义（图1，P=0.036）。

进一步分析CYP1B1各SNP位点与mRNA表达的关系（图2），与CG/GG基因型相比，rs1056836 CC基因型的CYP1B1 mRNA表达量显著升高，两组间差异具有统计学意义（P=0.025），其余7个SNP位点与CYP1B1 mRNA表达量之间未见相关性。

表2 CYP1B1标签SNPs与前列腺癌根治术后生化复发的关系Tab 2 Associations between CYP1B1 tag SNPs and biochemical recurrence ［n（%）］

讨 论

CYP1B1 rs1056836是位于外显子3的非同义替换SNP，导致亮氨酸突变为缬氨酸。之前关于CYP1B1基因多态性与前列腺癌关系的相关报道，其研究终点为前列腺癌发病，但结果并不一致［6-8］。荟萃分析对这些研究进行了总结，结果显示在亚洲男性中rs1056836与前列腺癌发病风险相关，与C等位基因携带者相比，G等位基因携带者的前列腺癌发病风险为1.52倍（95%CI：1.20～1.92），但在高加索人群中并无关联［9］。造成这一差异的原因可能有各种族基因型分布频率不同、环境因素影响和前列腺癌发病率差异等。CYP1B1 rs1056836的等位基因频率在不同的种族间具有显著的差异，其中G等位基因在亚洲人群中的频率约为16.76%，显著低于高加索人群的38.66%，两者间差异具有统计学意义（P＜0.01）［10］。本研究首次以前列腺癌根治术后生化复发为研究终点，在汉族人群中观察CYP1B1基因多态性与前列腺癌的关联性。结果显示，本组汉族人群中rs1056836基因频率约为22.3%，低于既往文献报道的G等位基因在高加索人群中的频率。同时，本研究还发现CYP1B1 rs1056836与前列腺癌根治术后生化复发之间有关联，CG基因型较CC基因型的生化复发风险显著降低（HR：0.65，95%CI：0.33～0.93，P=0.025）。

既往有研究观察CYP1B1 rs1056836与前列腺癌侵袭性之间的关系，如Beuten等［11］纳入393例高加索人，将Gleason评分≥7定义为高侵袭性前列腺癌，结果发现与CYP1B1 rs1056836 CC基因型携带者相比，GG基因型携带者患高侵袭性前列腺癌的几率降低约55%，差异具有统计学意义（OR：0.45，95%CI：0.24～0.84，P=0.01）。结合本研究的结果，我们认为CYP1B1可能在前列腺癌的进展阶段起关键作用，其表达升高后，CYP1B1可通过上调Sp1引起上皮细胞-间充质转化和激活Wnt/β-Catenin信号通路来增强肿瘤细胞增殖和转移［12］。

已有研究报道CYP1B1 SNP位点通过改变雌激素正常生理代谢或表达水平可影响个体的肿瘤发病风险［3-4］。据此，本研究假设位于CYP1B1编码区的rs1056836可能改变基因表达水平，进而导致前列腺癌的术后复发。随后的实验证实rs1056836确实与CYP1B1 mRNA表达相关。与正常前列腺细胞相比，前列腺癌细胞中CYP1B1的转录水平显著升高［13］。CYP1B1活性受到芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）、内源性雌激素和雌激素受体等多种机制调节。在侵袭性前列腺癌中AhR异常激活，CYP1B1催化雌激素氧化代谢生成儿茶酚雌激素和雌激素醌增多，最终导致前列腺癌细胞增殖和迁移增加［14］。

本研究存在一定的局限性，如病例数和随访时间相对有限，缺乏蛋白水平的验证，具体的生物学机制也有待进一步阐明。本研究发现CYP1B1编码区SNP rs1056836与前列腺癌根治术后生化复发风险有关，CC基因型携带者复发风险显著升高。对于行前列腺癌根治术的患者进行该位点的基因分型有助于判断复发风险，临床上可针对高危患者积极采取辅助治疗以改善预后。