灯盏花素TPGS聚合物胶束的制备工艺研究*

李云贵，轩贵平，姚海伦，邹 柳

(1 湖南环境生物职业技术学院，湖南 衡阳 421001；2 柳州市妇幼保健院，广西 柳州 454001)

灯盏花素(breviscapine)又叫灯盏细辛，是菊科植物短葶飞蓬(Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz)的干燥全草，其中主要成分是灯盏花乙素(又叫野黄芩苷)，另还含少量灯盏花甲素，其中灯盏乙素的含量占95%以上，为灯盏花素的主要有效成分[1]。现代医学研究表明：灯盏花素可以改善心脑微循环、增加血流量、抗氧化、抗炎及拮抗心机缺血再灌注损伤等药理作用[2-6]，其中最显著的作用是保护心脑血管[7-9]。目前上市的灯盏花素制剂中依然存在着生物利用度低，体内消除迅速，半衰期短等缺点。

为此，针对灯盏花素水溶性和脂溶性均差的特性，本实验选用以经SFDA认证的安全高分子材料聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯为聚合物脂质体载体材料包载灯盏花素，制备灯盏花素聚合物脂质体。

1 材 料

1.1 仪 器

KQ-250DE型超声仪，昆山市超声仪器公司；UV-1750紫外分光光度仪，岛津公司；Nano-ZS粒度测定仪，英国Malvern公司；XW-80A旋涡混合器，上海医科大学仪器厂；AG285型电子分析天平，瑞士METTLER公司；EM-1200EX透射电子显微镜，日本电子公司；X-射线衍射仪，日本Rigaku公司。

1.2 试 药

灯盏乙素标准品，中国药品生物制品检验所(批号：201707)；灯盏花素原料药，湖南恒生制药有限公司(批号：20180506)；聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯，阿拉丁试剂有限公司(批号：20180323)；其他试剂均为分析纯。

2 方 法

2.1 灯盏花素储备液的制备

精密称取50 mg灯盏花素原料药，置棕色容量瓶中，加入适量甲醇使其完全溶解后定容，最终得到1 mg/mL的灯盏花素储备液，置4 ℃冰箱中保存、备用。

2.2 聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯储备液的制备

精密称取聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯2.00 g，放入容量瓶中，加入适量甲醇进行溶解，稀释、定容至刻度，制得20 mg/mL的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯储备液，置4 ℃冰箱中保存、备用。

2.3 建立UV法测定Bre/TPGS脂质体的含量

2.3.1 检测波长的确定

取适量灯盏花素储备液，放入棕色容量瓶中，加入适量的甲醇溶液进行稀释、定容至刻度处，轻轻摇晃均匀，配制成0.04 mg/mL 的灯盏花素溶液，以甲醇溶液为空白参比，用UV法进行紫外吸收波长扫描来确定其最大吸收波长。

2.3.2 标准曲线的绘制

精密称取50 mg灯盏乙素标准品，置棕色容量瓶中，加入适量甲醇待其完全溶解后定容，摇匀，即得100 μg/mL的灯盏乙素标准品溶液。再用甲醇稀释定容至刻度，制备成浓度分别为4.00、6.00、8.00、10.00、12.00和14.00 μg/mL的一系列灯盏乙素标准品溶液。按照UV法确定的灯盏花素最适吸收波长处对这一系列标准品溶液进行测定，得系列标准品溶液的吸光度值(A)，以吸光度值对质量浓度(C)进行线性回归，绘制标准曲线。

2.3.3 精密度考察

分别配制低(4μg/mL)、中(8 μg/mL)、高(12 μg/mL)三种不同浓度的灯盏乙素标准品溶液，每个浓度设置三个平行组，按照UV法确定的最适宜的吸收波长在同一天内测定5次吸光度值A，考察其日内精密度，计算RSD。同法，用上述样品每天测定1次连续测定3 天吸光度值A，考察其日间精密度，计算RSD。

2.3.4 方法回收率

分别配制低(4 μg/mL)、中(8 μg/mL)、高(12 μg/mL)三种不同浓度的灯盏乙素标准品溶液，每个浓度设置三个平行组，按照UV法确定的最适吸收波长的吸光度值(A)，根据绘制的标准曲线方程，计算出灯盏乙素的实际测定浓度，可得出其方法回收率，即实际浓度/理论浓度×100%。

2.4 Bre/TPGS脂质体的制备

精密吸取5.00 mL的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯储备液(20 mg/mL)，置茄型瓶中，加入7.00 mL的灯盏花素储备液(1 mg/mL)，搅拌混匀后，用减压旋转蒸发回收甲醇，然后再加入蒸馏水10 mL，于37 ℃磁力搅拌2 h，再加甲醇溶解、搅拌，减压回收甲醇，用微孔滤膜过滤，即得Bre/TPGS脂质体。同上述方法，不加入灯盏花素即制得空白脂质体。

2.5 脂质体包封率及载药量的测定

精密吸取1.00 mL 的Bre/TPGS脂质体溶液，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释、定容到刻度，再从上述溶液中精密吸取3.00 mL溶液，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释、定容到刻度，超声10 min。测定脂质体中灯盏花素的含量，计算其的包封率(EE%)和载药量(DL%)。

包封率=M0/M1×100%

载药量=M0/M ×100%

式中：M为所制备的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与灯盏花素总投入的量；M0为脂质体中灯盏花素的量；Ml为脂质体前投入灯盏花素的量。

2.6 单因素法筛选Bre/TPGS的制备工艺

在实验过程影响聚合物脂质体形成的因素有很多，根据预实验基础，选取了水化温度、水化时间和药物与载体药物比等三个单因素进行考察，为下一步实验设计提供依据。

2.6.1 水化温度对Bre/TPGS脂质体的影响

精密吸取5.00 mL的Bre/TPGS脂质体储备液(20 mg/mL)，放入茄型瓶中，加入5.00 mL的灯盏花素储备液(1 mg/mL)，磁力搅拌混匀后，减压回收甲醇，然后再加入蒸馏水10 mL，于水化温度为37、50、60 ℃温度条件下磁力搅拌3 h，再加甲醇溶解、搅拌，减压回收甲醇，用微孔滤膜过滤，即为Bre/TPGS脂质体。

2.6.2 水化时间对Bre/TPGS脂质体的影响

精密吸取5.00 mL的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯储备液(20 mg/mL)，置茄型瓶中，加入5.00 mL的灯盏花素储备液(1 mg/mL)，磁力搅拌混匀后，用减压回收甲醇，然后再加入蒸馏水10 mL，于水化温度为37 ℃下磁力搅拌1、2、3、4、5 h，再加甲醇溶解、搅拌，减压回收甲醇，用微孔滤膜过滤，即为Bre/TPGS脂质体。

2.6.3 药物与载体药物比对Bre/TPGS脂质体的影响

精密吸取5.00 mL的聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯储备液(20 mg/mL)，置茄型瓶中，加入不同体积的灯盏花素储备液(1 mg/mL)，磁力搅拌混匀后，减压回收甲醇，然后再加入蒸馏水10 mL，于水化温度为37 ℃下磁力搅拌3 h，再加甲醇溶解、搅拌，减压回收甲醇，用微孔滤膜过滤，即为Bre/TPGS脂质体。

2.7 正交实验优化Bre/TPGS脂质体的制备工艺

通过正交实验来进一步优化Bre/TPGS脂质体的制备工艺，选择包封率为考察指标，考察了药物与载药量的比值(A)、水化温度(B)、水化时间(C)对脂质体包封率的影响，每个因素考察 3 个水平。设计L9(33)正交设计表，进行三因素、三水平正交实验，筛选出制备Bre/TPGS脂质体的最佳工艺。正交实验水平见表1。

表1 正交设计因素水平表

3 结果与讨论

3.1 Bre/TPGS脂质体的含量测定结果

3.1.1 检测波长的确定

分别取灯盏花素甲醇溶液和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯甲醇溶液进行紫外扫描，确定灯盏花素检测波长为335 nm。

3.1.2 标准曲线的绘制

采用UV法在335 nm 处分别测定已配置好一系列浓度的灯盏乙素标准品溶液的吸光度(A)，测定的数据结果见表2。其线性方程为：Y=0.0564X-0.0054，R2=0.9998。用于Bre/TPGS脂质体的含量测定。

表2 灯盏花素标准溶液标吸光度值A

3.1.3 精密度试验

低、中、高三种不同浓度灯盏乙素标准溶液的日内精密度实验结果见表3，日间精密度实验结果见表4。日内和日间精密度良好，RSD均小于3%，符合样品含量测定要求。

表3 灯盏花素日内精密度实验结果

表4 灯盏花素日间精密度实验结果

3.1.4 方法回收率试验

低、中、高三种不同浓度的灯盏乙素溶液的方法回收率实验结果见表5，RSD小于3%，表明此测定方法符合含量测定要求。

表5 灯盏花素方法回收率实验结果(n=3)

3.2 Bre/TPGS脂质体的制备工艺筛选结果

3.2.1 水化温度对Bre/TPGS脂质体的影响

固定药物与载体比例与水化时间，在制备过程中考察水化温度对脂质体的粒径、包封率和载药量的影响。从表6可知水化温度对聚合物的粒径影响较小，37 ℃时制备的聚合物脂质体的包封率和载药量较高。

温度/℃粒径/nm包封率/%载药量/%3717.32±1.3294.57±2.184.50±0.115015.07±1.1280.25±3.253.81±0.126016.71±1.6984.33± 2.214.01±0.06

3.2.2 水化时间对Bre/TPGS脂质体的影响

固定药物与载体比例与水化温度，在制备过程中考察水化时间对脂质体的粒径、包封率和载药量的影响。从表7中可知，脂质体的粒径受水化时间的影响变化不大，在3 h时药物的包封率达到94.57%。

水化时间/h粒径/nm包封率/%载药量/%128.31±2.3280.25±3.153.80±0.04223.86±1.2286.25±1.254.11±0.05317.32±1.3294.57±2.184.50±0.11421.84±1.6983.33±3.213.96±0.15527.42±3.2672.46±1.743.45±0.08

3.2.3 药物与载体比例对Bre/TPGS脂质体的影响

从表8中数据可知，固定水化温度与水化时间，在制备过程选取6个不同药物与载体比考察其对脂质体的粒径、包封率和载药量的影响。

表8 不同药物与载体比例对Bre/TPGS脂质体的影响n=3)

3.3 Bre/TPGS脂质体的制备工艺优化结果

通过正交实验来进一步优化Bre/TPGS脂质体的制备工艺，选择包封率作为考察指标，考察药物与载药量的比值(A)、水化温度(B)、水化时间(C)对脂质体包封率的影响。根据L9(33)正交设计表，进行三因素、三水平正交实验，筛选出制备Bre/TPGS脂质体最佳工艺。

3.4 正交实验最佳制备工艺的验证

精密称取100 mg聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯，置茄型瓶中，加入7.00 mL灯盏花素甲醇溶液(1 mg/mL)，搅拌混匀后，减压回收甲醇，然后再加入蒸馏水10 mL，在37 ℃水化温度，磁力搅拌水化2 h，再加甲醇溶解，减压回收甲醇，用微孔滤膜过滤，按照此最优方法制备3批Bre/TPGS脂质体。 Bre/TPGS脂质体的包封率为90%±2.62%(n=3)，RSD为2.36%。该结果表明，A2B1C2实验方案的实验结果重现性良好，即制备的Bre/TPGS脂质体具有良好的稳定性。

4 讨 论

灯盏花素在波长335 nm处有最大吸收峰，且载体药物聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯在此波长处不干扰药物的含量测定，具有良好专属性和精密度。实验证明，采用薄膜溶剂挥发法制备Bre/TPGS脂质体，包封率与载药量有较大提高。实验的过程中，选择对载药量和包封率影响较大的单因素，进行L9(33)正交设计实验来优选Bre/TPGS脂质体的制备工艺。通过该法制备聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯脂质体工艺简单，其粒径、包封率、载药量均可控，并具有一定的缓释作用，为进一步临床应用提供参考。