隐匿性HBV感染无偿献血人群KIR基因多态性的特征分析

张 涛, 毛 伟, 王栋芳, 蒋玉林, 杨丹蓉, 尹 丹, 杨 虎, 欧阳熊妍, 谭茜茜

重庆市血液中心 输血研究所，重庆 400015

采用酶联免疫吸附法检测血清中HBsAg是采供血机构用于筛查血液安全的法定检测方式之一。近年来随着病毒核酸检测技术的开展，发现在HBsAg阴性的人群中检出HBV DNA，这种除“窗口期”外的HBsAg(-)/HBV DNA(+)的感染定义为隐匿性乙型肝炎病毒感染( occult hepatitis B virus infection，OBI) ，主要表现为低病毒载量水平的感染[1]。在OBI的发病机制中，宿主免疫应答是一个不可忽略的因素，其NK细胞在机体免疫监视和抗病毒感染等方面起着重要作用。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)是NK细胞表面的重要受体，是具有高度多态性的多基因家族，通过传导激活性或抑制性信号调节NK细胞的活性和机体的免疫应答。本研究拟分析无偿献血人群中OBI献血者的KIR基因多态性特征，探讨OBI感染和KIR基因多态性的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2016年6月-2019年6月重庆市血液中心采集的18～55岁的无偿献血者血液标本，选择血清学筛查HBsAg阴性而病毒核酸检测技术[TIGRIS全自动血液核酸检测仪(美国诺华公司)，运用Pro- cleix Ultrio assay(Chiron Gene-Probe，Emeryville，San Diego，CA，USA)方法进行三联荧光病毒核酸检测]筛查HBV DNA阳性，同时经随访排除“窗口期”的献血者作为研究对象(OBI组)。收集所有研究对象的外周血标本5～8 ml，-80 ℃冷冻保存。本研究通过重庆市血液中心医学伦理委员会审批，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 仪器和试剂 PCR扩增仪(9700型，美国ABI)；流式荧光检测仪Luminex®200(美国Luminex)；血液基因组柱式小量提取试剂盒(批号30327，康为世纪)；KIR基因分型试剂LIFE CODES KIR-SSO TYPING KIT(批号：3006648，美国IMMUCOR)。

1.3 DNA提取 采用柱提法从冻存(-80℃)的全血标本中提取DNA。DNA纯度在1.60～2.00，调整DNA浓度为10～50 ng/μl，按照试剂盒说明书操作。

1.4 KIR基因分型 首先进行PCR扩增，程序：95 ℃ 2 min，1个循环；94 ℃ 30 s，59 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s，40个循环； 72℃ 15 min，1个循环；4 ℃ 结束。取扩增产物进行杂交、洗涤、上机检测。本方案可检测出KIR 2DS4在第5外显子上有22bp缺失的变异体(KIR 2DS4*del，也称为KIR 1D)。

2 结果

2.1 KIR基因分布情况 OBI组105例患者的平均年龄为(38.5±1.8)岁，其中男65例(61.9%)，女40例(38.1%)，均为汉族，KIR基因分布见表1。105例OBI献血者均含有的KIR基因有2DL4、3DL2、3DL3和假基因3DP1；F>70%的KIR基因有2DL1、2DL3、3DL1、2DS4和假基因2DP1，其中KIR 2DS4 第5外显子存在缺失的F为26.3%,F<30%的基因有2DL2、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、3DS1。

表1 105例OBI献血者KIR基因分布

2.2 OBI献血者与不同地区健康人群的KIR基因分布比较 OBI献血者与不同地区健康人群的KIR基因分布比较见表2，OBI献血人群分别与重庆汉族、河北汉族、江苏汉族和拉萨藏族比较，KIR 2DL3基因表型频率均降低(χ2分别为9.598、12.236、13.719、10.974，P值均<0.05)(表2)；OBI献血人群2DL2、2DL5、2DS2、2DS3与乌市维族比较差异均有统计学意义(χ2值分别为16.215、6.981、19.498、11.819，P值均<0.05)；OBI献血人群2DL2、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4与高加索人比较差异均有统计学意义(χ2分别为22.477、3.877、34.937、6.909、4.271，P值均<0.05)；OBI献血人群与重庆汉族相比，KIR 2DS4*del频率升高(χ2=12.911，P<0.05)。

2.3 OBI献血者与不同病种人群的KIR基因分布比较

OBI献血人群与长期慢性HBV感染组相比，2DS2、2DS3频率降低(χ2分别为13.005、8.289，P值均<0.05)，但2DS4、3DL1频率升高(χ2分别10.032、3.865，P值均<0.05)；OBI献血人群与强直性脊柱炎组相比，2DL3、2DS3基因表型频率降低(χ2分别为7.851、16.504，P值均<0.05)；OBI献血人群与男男同性恋(MSM)HIV-AIDS 组相比，2DS4、3DL1基因频率升高(χ2分别为15.491、4.475，P值均<0.05)。OBI献血人群与散发性急性戊型肝炎组相比，2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、2DS4、3DL2、3DL3、2DP1差异均有统计学意义(χ2分别为4.448、30.934、17.942、15.638、4.227、13.802、32.667、35.653、36.566，P值均<0.05)(表3)。

表2 OBI献血者与不同地区健康人群的KIR基因表型频率的比较(%)

注： 与OBI献血者比较，1)P<0.05。

表3 OBI献血者与不同病种人群KIR基因表型频率的比较(%)

注： 与OBI献血者比较，1)P<0.05。

2.4 OBI献血者与不同病种人群、不同地区健康人群的KIR 基因型比较 目前发现人类KIR主要有A和B两种单倍型，其基因数量和种类均不同。单倍型A除了KIR 2DS4之外均是抑制性KIR基因，包括2DL1、2DL3、3DL1、3DL2。单倍型B包含2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、3DS1等不同组合的基因。KIR基因是以单体型的形式遗传，在特定人群中，这些单体型组合形成特定基因型，包括AA、BX(AB和BB)。具体可通过国际等位基因网站http://www.allelefrequencies.net/kir6001a.asp输入各个KIR基因检测的结果，由系统自动判别每一例KIR的基因型。

105例OBI献血者中共发现21种KIR基因型，均可指定ID号。其中基因型AA1最为常见(49.5%)，其次为BX2(18.1%)，有12种基因型在该人群中仅出现1次(表4)。单倍体 A 在 OBI献血者和强直性脊柱炎、不同地区健康对照组所占的比例与单倍体B比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

3 讨论

KIR是一类表达于NK细胞和某些T淋巴细胞表面的重要受体，通过识别和结合HLA-Ⅰ类分子，传递活化或抑制信号来调节NK细胞的功能和杀伤活性，在抗病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病等的发生发展中起着重要作用[14]。KIR分子具有高度多态性，遗传基础源于KIR基因多态性，表现在不同的单体型中，KIR基因数量和种类均可能不同，是继HLA之后发现的具有高度多态性的免疫调节基因家族。有研究[15]报道，KIR基因多态性将影响到其与配体结合的特异性和稳定性，有可能影响HBV感染后的机体免疫反应及其临床预后。

OBI是HBV感染中的一种特殊类型，因其血清中病毒载量低而不易被发现，成为临床和流行病学的一大难题[16]。近年来，采供血系统为提升血液安全逐渐采用核酸筛查技术进行经血传播疾病的排除。本研究中，不能直接检测献血者肝脏组织中的HBV DNA，因而将血清学检测 HBsAg阴性而核酸检测技术筛查HBV DNA阳性的献血者定义为OBI献血者。本研究首次关注了无偿献血人群中OBI献血者的KIR基因多态性特征，在105例OBI献血者中检出了KIR目前已知的16种基因，包括 KIR 2DL1-5、2DS1-5、3DL1-3、3DS1、2DP1、3DP1，以及KIR 2DS4 等位基因第5外显子存在 22 bp 缺失而产生无激活效应的变异体 KIR 2DS4*del。可以看出，OBI献血者中抑制性KIR基因的检出频率普遍高于激活性KIR基因，这与健康人群中的特征一致。通过比较各个KIR基因在OBI献血者与重庆汉族、河北汉族、江苏汉族和我国健康人群中的频率可以看出，KIR 2DL3在OBI献血者中的分布频率均低于上述人群，而与乌市维族和高加索健康人群一致。乌市维族和高加索健康人群均是HBV感染的低流行地区，这提示KIR 2DL3可能是HBV感染的保护性基因。 Gao等[17]研究发现KIR 2DL3-HLA-C1具有较强的保护作用，di Bona等[18]发现KIR 2DL3与其配体结合有助于HBV的自发清除，Zwolinska等[19]的研究显示只有KIR 2DL2基因而没有KIR 2DL3基因会让HIV易感率増加4倍以上，这些结果与本研究结论相似。但KIR 2DL3保护机体免受病毒感染的具体作用机制尚未明确，推测可能与KIR 2DL3与相应配体结合后分泌更多的干扰素有关[20]。此外，有文献[8]表明，KIR 2DS2、2DS3是HBV易感基因，能诱导持续较弱的炎症反应。而KIR 2DS1、3DS1、2DL5可能是保护基因，可以促进HBV的清除。其他研究[21]也表明，KIR 2DS3基因频率在梅毒、慢性乙型肝炎和丙型肝炎患者中升高。本研究将OBI献血者与文献报道的HBV感染组作比较，KIR 2DS2、2DS3基因频率降低，而KIR 2DS4、3DL1频率升高，提示OBI献血者低病毒载量可能与NK细胞KIR活化和抑制信号的平衡关系有关，也与KIR-配体间相互作用、种族、地域、病毒特征等有关，而不单纯取决于KIR基因多态性。

表4 OBI献血者与不同病种人群、不同地区健康人群的KIR基因型频率的比较(%)

KIR 2DS4是携带频率在90%以上的唯一活化性基因，也是单倍型A唯一的激活性KIR基因，提示这一基因在NK细胞的功能调控和疾病相关性中可能发挥重要作用。KIR 2DS4在第5外显子缺失22 bp ，产生变异体KIR 1D编码可溶性分子，编码蛋白无法锚定在细胞膜上导致激活信号不能传递，因此KIR 1D可屏蔽KIR 2DS4或NK细胞上其他受体的配体或作为清除可溶性HLA的诱导物，干扰NK细胞功能[22]。 Zhuang等[23]研究结果显示，中国汉族梅毒患者KIR1D 纯合子的基因频率较正常对照组显著增高(16.9% vs 6.6%，χ2=4.596，P<0.05)，提示KIR 1D 纯合子可能与中国汉族人群的梅毒易感性相关。在OBI献血者中同样观察到携带有KIR 2DS4*del基因的频率较重庆汉族健康人群升高(45.7 %vs 26.9%，χ2=12.911，P<0.05)，显示出同梅毒人群中的易感性特征。但在普通的HBV感染人群中，Pan等[24]报道了101例慢性HBV感染患者中有26例携带有KIR 1D，明显低于OBI献血者的频率(45.7% vs 25.7%，χ2=8.921，P<0.05)。因此，KIR 2DS4*del可能是HBV感染的一个易感基因，但也可能是OBI献血者低病毒载量的一个有利因素，可能与病毒特征、配体特异性等相关，下一步本研究团队将就此展开研究。

KIR的基因型由2条单倍体构成，本研究发现单倍体A在OBI组、强直性脊柱炎和健康对照组所占的比例均高于单倍体B，但这两种单倍体在两组之间不存在明显的统计学差异，表明单倍体型分布情况在OBI中的致病作用关系不大。HLA-Ⅰ类基因是KIR的配体，两者间的相互作用以及HLA和KIR作为人体多态性最丰富的基因系统，造成了某些特定基因人群可能无法清除低水平的HBV从而产生OBI。因此，探明KIR与HLA-Ⅰ类基因组合在OBI感染过程中的易感性和保护性作用，进一步多地区、大样本及深层的免疫学研究，阐明NK细胞调节HBV感染的机制是非常必要的。