外周血淋巴细胞亚群在慢性HBV感染过程中表达的变化分析

翁奉武，郭丽颖，李秋伟，李 力，赵立聪，孙小雪，尹美君，贾建伟

1 天津中医药大学 研究生学院，天津 301617；2 天津市第二人民医院 中医、中西医结合Ⅰ科，天津 300192

HBV感染是全球性的重大公共卫生问题，HBV感染慢性化是发展为肝硬化和肝癌的主要危险因素[1]。据世界卫生组织估计，全世界约有2.57亿人存在慢性HBV感染[2]，其中我国约有9300万HBV感染者[3]。慢性HBV感染的临床表现主要为肝炎-肝硬化-肝癌3个阶段，不同阶段的临床特征各异。免疫功能是贯穿慢性HBV感染病程发展的一项重要因素。外周血淋巴细胞亚群数量的变化及功能特征可以有效反映机体的免疫状态，慢性HBV感染者常伴随淋巴细胞亚群功能失衡及紊乱，淋巴细胞免疫应答的特异性和强度显著降低、功能耗竭，从而不能有效地识别和清除HBV，进而加重肝细胞损伤和炎症反应[4-5]。本文将探讨慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、乙型肝炎肝硬化相关原发性肝癌患者外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的表达情况，从而揭示慢性HBV感染疾病进展过程中外周血淋巴细胞亚群的变化趋势。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月-2019年4月在天津市第二人民医院住院的慢性HBV感染患者，分为慢性乙型肝炎组、肝硬化组和肝癌组，所有患者ALT<2倍正常值上限(ULN)，TBil<1.5×ULN，高敏HBV DNA<20 IU/ml，肝功能Child-Pugh评分为A级，均已接受核苷(酸)类似物抗病毒治疗，治疗时间>6个月。选择同期健康体检者作为对照组。本研究经由天津市第二人民医院医学伦理委员会审批(批号：201818)，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 纳入和排除标准 纳入标准：符合慢性HBV感染所致的慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌的患者，其中慢性乙型肝炎、肝硬化诊断参考《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[6]；肝癌诊断参考中《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》[7]。排除标准：(1)急性HBV感染者；(2)合并其他病毒(HAV、HCV、HIV等)感染者；(3)合并其他(脂肪性、酒精性、药物性、自身免疫性等)慢性肝病患者；(4)继发性肝癌或其他肿瘤患者；(5)合并严重感染、肝性脑病、消化道出血等并发症患者；(6)妊娠及哺乳期妇女。

1.3 检测方法

1.3.1 生化指标检测 采用全自动生化分析仪(HITACHI 7180)检测ALT、TBil水平。

1.3.2 高敏HBV DNA检测 采用实时荧光定量PCR检测仪(Roche COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan)和配套试剂盒检测HBV DNA载量。

1.3.3 外周血淋巴细胞亚群精准计数检测 采集乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝外周血50 μl于绝对计数管(BD Trucount管)中，加入相应的CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+CD56+20 μl荧光标记流式抗体(BD Multitest试剂)，混匀，室温避光放置20 min。再加入450 μl溶血素(BD FACS溶解液)，混匀，室温避光放置20 min，采用流式细胞术(BD FACSCanto流式细胞仪)检测外周血淋巴细胞亚群精准计数。

1.4 统计学方法 使用SPSS21.0统计软件进行数据分析。正态分布的计量资料以±s表示，组间方差不齐采用Welch方差分析，两两比较采用Games-Howell检验。非正态分布的计量资料以M(P25～P75)表示，多组间及进一步两两比较采用Kruskal-WallisH检验。计数资料组间比较采用χ2秩相关分析法。相关性分析采用Spearman秩相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入慢性HBV感染患者132例，其中男88例，女44例，年龄23～79岁，平均年龄(52.30±12.05)岁；慢性乙型肝炎组47例，肝硬化组44例，肝癌组41例。健康体检者42例，其中男20例，女22例，年龄21～79岁，平均年龄(51.48±15.83)岁。4组性别、年龄、ALT、TBil水平比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表1)，具有可比性。

表1 4组性别、年龄和肝功能指标比较

2.2 4组外周血T淋巴细胞亚群表达情况 慢性HBV感染患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T淋巴细胞在对照组、慢性乙型肝炎组、肝硬化组和肝癌组中比较，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。与对照组和慢性乙型肝炎组相比，肝硬化组和肝癌组CD3+、CD4+T淋巴细胞数量明显减少，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。与对照组相比，肝癌组CD8+T淋巴细胞数量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与慢性乙型肝炎组相比，肝硬化组和肝癌组CD8+T淋巴细胞数量明显减少，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表2)。

表2 4组外周血T淋巴细胞亚群精准计数比较

注：与对照组比较，1)P<0.05；与慢性乙型肝炎组比较，2)P<0.05。

2.3 4组外周血B淋巴细胞表达情况 慢性HBV感染患者外周血CD19+B淋巴细胞在对照组、慢性乙型肝炎组、肝硬化组和肝癌组中比较，差异有统计学意义(P<0.001)。与对照组和慢性乙型肝炎组相比，肝硬化组和肝癌组CD19+B淋巴细胞数量明显减少，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表3)。

表3 4组外周血B淋巴细胞精准计数比较

注：与对照组比较，1)P<0.05；与慢性乙型肝炎组比较，2)P<0.05。

2.4 4组外周血NK细胞表达情况 慢性HBV感染患者外周血CD16+CD56+NK细胞在对照组、慢性乙型肝炎组、肝硬化组和肝癌组中比较，差异有统计学意义(P<0.001)。与对照组相比，肝硬化组和肝癌组CD16+CD56+NK细胞数量明显减少，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；与慢性乙型肝炎组比较，肝癌组CD16+CD56+NK细胞数量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表4 4组外周血NK细胞精准计数比较

注：与对照组比较，1)P<0.05；与慢性乙型肝炎组比较，2)P<0.05。

2.5 不同疾病状态与外周血淋巴细胞亚群相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，4组疾病进展与外周血CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD16+CD56+NK细胞呈明显负相关(r值分别为-0.414、-0.503、-0.269、-0.435、-0.402，P值均<0.01)。其中CD4-+T淋巴细胞与疾病进展的相关性最大(r=-0.503)。

3 讨论

HBV感染过程中，免疫功能健全者有机会凭借自身机体免疫反应将病毒清除而痊愈，而绝大多数患者为母婴或父婴垂直传播而来，可能存在一定的免疫缺陷，不能完全清除病毒，病情将持续缓慢进展。先天免疫系统是机体抵御病毒感染的一线防御机制，受感染的肝细胞和肝内固有免疫细胞识别病毒，诱导直接抗病毒机制，并进一步调节先天性和适应性免疫应答[8]。宿主的免疫反应不足被认为是导致慢性HBV感染的关键因素[9]，因此免疫功能在慢性HBV感染的发生和进展中发挥着重要作用。

淋巴细胞是机体免疫系统的重要细胞成分，主要包括T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD19+)和NK细胞(CD16+CD56+)。其中NK细胞执行先天性免疫反应，T淋巴细胞和B淋巴细胞执行适应性免疫反应。先天性免疫控制对病毒感染的最初反应，而特定的细胞免疫和体液免疫则消除病原体和防止再感染[10]。T淋巴细胞主导机体细胞免疫，具有抵抗病毒和调节免疫功能的作用。CD3+T淋巴细胞代表总成熟T淋巴细胞，反应机体细胞免疫功能状态；CD4+T淋巴细胞是辅助性T淋巴细胞(Th)，介导迟发性超敏反应，协助B淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞行使免疫应答功能，是免疫应答中清除病毒的重要细胞；CD8+T淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞(Tc)，在免疫反应中直接与靶细胞结合释放颗粒酶和穿孔素而杀伤靶细胞，是引起病毒感染后肝细胞损伤的主要细胞[11]。正常情况下，CD4+、CD8+T淋巴细胞互相拮抗保持平衡，HBV感染后，Tc迅速增殖分化，当比例失衡，免疫功能则发生紊乱[12-14]。B淋巴细胞是主导机体体液免疫的关键细胞，通过产生高亲和力病毒特异性抗体，以中和病毒[15]。NK细胞主导某些肿瘤细胞和病毒感染细胞无需预先致敏的细胞毒性作用，是机体在免疫应答中抗肿瘤、抗病毒感染以及免疫监控的重要因素，在机体清除HBV的过程中起到了不可或缺的作用[16]。

本研究检测了132例慢性HBV感染者以及42例健康者的外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞和NK细胞的表达水平，结果显示，肝硬化组和肝癌组CD3+T淋巴细胞数量与对照组和慢性乙型肝炎组相比明显减少，且随着慢性HBV感染的加重，即从慢性乙型肝炎-肝硬化-肝癌的过程中，CD3+T淋巴细胞数量逐渐减少，提示T淋巴细胞亚群和疾病的进展有着密切关系；肝硬化组和肝癌组CD4+T淋巴细胞数量减少提示在慢性HBV感染过程中，机体内CD4+T淋巴细胞免疫功能降低，导致HBV不易被清除，进一步导致感染的加重。肝癌组CD8+T淋巴细胞数量减少，提示肝癌患者抗肿瘤效应明显较低。刘恩惠等[17]通过对慢性HBV感染者不同病理状态外周血淋巴细胞亚群变化的研究发现，炎症程度≥G2组CD8+T淋巴细胞水平低于

综上所述，慢性HBV感染患者机体免疫功能降低，介导免疫反应的免疫活性细胞数量减少，无法有效清除体内病毒，造成肝细胞持续损伤，从而使病情进一步发展。本研究基于外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞和NK细胞的表达情况，发现免疫细胞在慢性HBV感染发生进展和预后中的重要作用，认识到提升外周血淋巴细胞亚群的状态对于预防和治疗慢性HBV感染具有重要意义。