超声波对乌鳢短肽- 锌结构及抗氧化性的影响

汪婧瑜， 张业辉， 阮奇珺， 张友胜， 刘学铭， 陈智毅， 程镜蓉， 王旭苹

(广东省农业科学院 蚕业与农产品加工研究所/农业农村部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室， 广东 广州 510610)

乌鳢(Channaargus)是营养价值较高的名贵淡水鱼类，肉质细嫩鲜美，营养丰富。乌鳢生存能力极强，可离水存活2～3 d，死后机体不易腐败变质，具有特殊的生理结构，因而乌鳢肉是制备营养保健食品的优选原料。锌缺乏可导致生长迟缓，性腺功能低下，免疫系统受损，神经功能障碍等疾病[1]，尤其在婴儿、学龄前儿童、孕妇、哺乳期妇女以及老年人中普遍存在[2]。新型的肽- 锌复合物可以利用小肽的吸收模式促进锌元素的吸收，提高锌的生物利用度，起到额外补充锌元素的作用。但是在现有的螯合技术中，螯合时间长、能耗大，不仅影响了螯合物的生产效能，也在一定程度上制约了淡水鱼水解肽螯合物的研究和应用。

超声波技术作为新型的非热加工技术，能快速、高效地提高食品品质，还具有开发功能独特新产品的潜力[3]。超声波技术的特殊效应如空穴效应、机械效应、热效应、化学效应等，不仅能辅助提取、加速反应，还能改变蛋白质的分子特性，从而改善蛋白质的理化性质和功能特性[4-6]。目前关于超声波加快螯合反应速率、提高螯合物稳定性的研究还较少，本研究以营养丰富的乌鳢为原料，探究超声波处理对乌鳢短肽- 锌(Channaargusshort peptide-zinc，CASP-Zn)结构及抗氧化活性的影响，以期为乌鳢蛋白的深加工提供参考，为超声波技术在螯合肽生产中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乌鳢，购于广东省广州市华润万家超市；胰蛋白酶(牛胰，250 U/mg)、盐酸、氢氧化钠、铬黑T、乙二胺四乙酸(EDTA)、硫酸锌、无水乙醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、过氧化氢、邻苯三酚等试剂，均为分析纯。 混合标准品：细胞色素C(12 500 u)、杆菌肽(1 450 u)、Gly-Gly-Tyr-Arg(451 u)、Gly-Gly-Gly(189 u)，均为优级纯，中国计量科学研究院。

1.2 仪器与设备

BSA224S- CW型分析天平，德国Sartorius公司；FE- 28型pH计，瑞士Mettler Toledo公司；TGL- 16M型高速冷冻离心机，湖南湘仪有限公司；1- 2LD- Plus型真空冷冻干燥仪，德国 Marin Christ 公司；UV- 1800型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；F- 7000型荧光分光光度计，日本日立公司；Transsonic T1- H- 10型超声波清洗仪，德国Elma公司；Leo- 1530vp型场发射电子扫描显微镜，德国LEO公司；JME- 2100型高分辨透射电子显微镜，日本电子株式会社。

1.3 实验方法

1.3.1CASP-Zn的制备

取实验室自制乌鳢短肽(CASP)[7]，配成质量分数为2%的溶液，按2∶1(短肽与硫酸锌质量比)的比例加入硫酸锌，搅拌均匀。调溶液pH值为7.0，在70 ℃下，按不同超声功率(0、120、240、360、480 W)超声一段时间。加入4倍体积无水乙醇醇沉1 h，10 000 r/min离心10 min。取沉淀，60 ℃鼓风干燥，得到不同CASP- Zn样品。螯合率的测定：采用EDTA滴定法[8]。

1.3.2CASP分子量分布测定

样品的处理：用流动相配制标准品；先用质量分数为15%的TCA与短肽溶液等体积混合除去杂蛋白，再用双倍的流动相与去除杂蛋白的短肽溶液混合，0.22 μm滤头过滤，制备1 mL的样品。

色谱条件：TSK gel G2000SWXL型色谱柱(300 mm×7.8 mm)；流动相为乙腈、水、三氟乙酸，体积比为10∶90∶0.1，流速为0.5 mL/min；检测波长为UV 220 nm，柱温为30 ℃，进样体积为20 μL 。

1.3.3CASP-Zn结构分析

氨基酸分析：采用GB/T 5009.124—2016[9]中方法进行测定。

紫外光谱分析：将CASP- Zn样品配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液，于190～400 nm测定CASP-Zn紫外吸收光谱，以蒸馏水为空白对照。

荧光光谱分析：参照曾庆瑞等[10]的方法。将不同CASP- Zn样品配制成2 mg/mL的溶液，在室温下设置激发波长为280 nm，于290～520 nm波长测定CASP-Zn发射光谱。以蒸馏水为对照。

扫描电镜分析：将CASP- Zn干燥粉末样品均匀涂在样盘双面胶上，喷金镀膜处理后，利用场发射电子扫描显微镜，在放大10 000倍条件下观察CASP-Zn微观结构。

1.3.4CASP-Zn抗氧化活性的测定

DPPH自由基清除率的测定：参照Borawska等[11]的方法。

超氧阴离子自由基清除率的测定：参照Cheung等[12]的方法。

H2O2清除率测定：参照赵姝雯等[13]的方法。

1.4 数据处理

采用SPSS软件进行数据分析，采用Origin 9.0软件绘图。数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 CASP的分子量分布

图1反映了CASP的分子量大小分布情况。由图1发现，CASP的主要成分由3部分组成，属于混合肽，其保留时间分别为20.388、22.803、23.444 min。混合标准品中，细胞色素C、杆菌肽、Gly- Gly- Tyr- Arg、Gly- Gly- Gly的保留时间分别为16.079、20.117、21.594、22.919 min。混合标准品中，各标准品分子量大小分别为12 500、1 450、451、189 u。通过与标准品比较，得出CASP三个组分的分子量大小都在1 450 u以下，基本以小分子短肽为主。

峰4～7分别为标准品细胞色素C、杆菌肽、Gly- Gly- Tyr- Arg、Gly- Gly- Gly。图1 混合标准品及CASP的分子量分布Fig.1 Molecular weight distribution of mixed standard and CASP

2.2 CASP与CASP- Zn氨基酸分析

短肽与螯合锌的氨基酸组成成分见表1。由CASP中共检测出15种氨基酸，CASP- Zn检测出16种氨基酸，其中CASP中Glu含量最高，为3.35 mg/g；Asp含量次之，为2.95 mg/g。CASP- Zn中Glu含量最高，为5.23 mg/g；Asp含量次之，为4.83 mg/g。呈酸性的氨基酸含量显著增加，说明CASP中酸性氨基酸与锌离子发生了螯合反应。CASP中芳香族氨基酸Tyr、Phe总质量比为2.76 mg/g，占总氨基酸的11.34%，而CASP- Zn中芳香族氨基酸质量比为2.70 mg/g，占总氨基酸的 8.13%。

表1 CASP与CASP- Zn的氨基酸组成

1)由于酸水解导致色氨酸(Trp)被破坏，所以未能检测到Trp；2) *为抗氧化活性较强的氨基酸。

与CASP相比，CASP- Zn中芳香族氨基酸含量下降。另外，CASP中，抗氧化活性较强的氨基酸Met、Try、Lys、His总质量比为5.71 mg/g，占总氨基酸质量比的23.46%；CASP- Zn的抗氧化性氨基酸总质量比为6.82 mg/g，占总氨基酸的20.54%。说明，与锌离子螯合后，CASP的抗氧化活性发生改变。

2.3 超声波处理对CASP- Zn螯合率的影响

不同超声功率和超声时间对CASP- Zn螯合率的影响显著，实验结果见图2。随着超声功率的加强，CASP- Zn的螯合率升高，超声功率为360 W时，CASP- Zn的螯合率最高，达到93.0%左右，但是超声功率再增加，其螯合率反而下降。出现这种现象可能是超声波的空穴效应改变了短肽的结构，促进了短肽与微量元素的螯合，提高了螯合率。当超声功率太强时，短肽发生聚合和变性[14]，降低了短肽与微量元素的结合能力，使得螯合率下降。另外，在较短的超声时间内(15 min)，CASP- Zn的螯合率达到较高值。随着超声时间的延长，其螯合率趋于稳定，这可能是超声波促进螯合反应的发生，使得螯合反应在较短时间内达到平衡。说明超声波处理不仅能提高螯合率，还能加速螯合反应的发生，这与李籽萱等[15]的研究结果相似。

图2 超声波处理对CASP- Zn螯合率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic treatment on chelating rate of CASP- Zn

2.4 超声波处理对CASP- Zn结构的影响

2.4.1超声波处理对CASP-Zn光谱结构的影响

短肽与螯合物形成的变化可以通过紫外吸收光谱的强度和位移变化来判断[16]，超声波处理后CASP- Zn的紫外光谱如图3。从图3中可以看出，短肽与超声波处理后CASP- Zn的紫外最大吸收峰在274 nm左右，其中短肽的最大吸收峰强度为0.832，不同功率超声波处理后CASP- Zn的吸收峰强度分别为0.601、0.659、0.592、0.728、0.571。通过比较发现，CASP- Zn的吸收峰强度较短肽弱；360 W超声波处理的CASP- Zn的最大吸收峰强度较其他处理的最强。这一变化说明，锌离子与短肽发生反应，形成新的物质CASP- Zn。经过超声波处理后，由于超声波的特殊效应，改变短肽的结构，影响锌离子与短肽的结合位点，从而改变了CASP- Zn的结构，产生不同的紫外吸收峰。

图5 超声波处理对CASP- Zn微观结构的影响Fig.5 Effect of ultrasonic treatment on surface microstructure of CASP- Zn

芳香氨基酸(Phe、Tyr、Trp)可以在一定的激发波长下产生内源性荧光[17]。超声波处理后，CASP- Zn的荧光强度发生变化，实验结果见图4。从图4中可以看出，CASP与超声波处理后CASP- Zn的荧光强度为352～357 nm。与CASP相比，CASP- Zn的荧光强度下降；而超声波处理后，CASP- Zn的荧光强度发生改变，与其他超声波处理的CASP- Zn相比，360 W超声波处理的CASP- Zn的荧光强度最强。产生这一变化的原因可能是，锌离子与短肽中芳香族氨基酸反应，改变了芳香族氨基酸的结构，使得荧光强度降低。氨基酸组成分析显示，短肽与螯合锌芳香族氨基酸含量不同，验证锌离子与短肽形成螯合物，导致荧光猝灭；也有研究表明，螯合过程中，由于短肽的折叠或聚集，金属离子的引入会导致固有荧光的猝灭[18]，而超声波处理，加速螯合反应，促进了锌离子与短肽结合，从而改变荧光强度。

图3 超声波处理对CASP- Zn紫外光谱的影响Fig.3 Effects of ultrasound treatment on UV spectra of CASP- Zn

图4 超声波处理对CASP- Zn荧光光谱的影响Fig.4 Effects of ultrasound treatment on fluorescence spectra of CASP- Zn

2.4.2超声波处理对CASP-Zn微观结构的影响

超声波处理改变了CASP- Zn的微观结构，实验如图5。从图5中可以看出，短肽表面光滑平整；CASP- Zn表面不平整，有孔状结构。未经过超声波处理的CASP- Zn表面有粒状结晶，孔隙较大；120 W超声波处理的CASP- Zn，表面颗粒呈粒状和片状，孔隙变小；240 W超声波处理的CASP- Zn，表面呈片状，孔隙变大；360 W超声波处理的CASP- Zn，表面呈片状，且堆叠在一起，没有孔隙；480 W超声波处理的CASP- Zn，表面粒状结晶分布密集，孔隙很小。比较发现，经过360 W超声波处理后的CASP- Zn结合最紧密，这表明360 W超声波处理后的CASP- Zn结构最稳定，进一步说明超声波处理能提高螯合物的稳定性。

2.5 超声波处理对CASP- Zn抗氧化活性的影响

研究发现，牡蛎肽- 锌复合物具有抗氧化活性[17]。通过对CASP- Zn的DPPH自由基、超氧阴离子自由基和H2O2清除率的测定，反映了CASP- Zn的抗氧化活性，实验结果见图6。从图6发现，随着样品质量浓度的升高，CASP和CASP- Zn对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和H2O2的清除率逐渐增强，但与维生素C相比，CASP和CASP- Zn对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和H2O2的清除率都弱于维生素C。这说明CASP和CASP- Zn具有一定的抗氧化活性。在同一质量浓度下，CASP和超声波处理前后的CASP- Zn的DPPH自由基、超氧阴离子自由基和H2O2的清除率差异显著。超声波处理后，CASP- Zn对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和H2O2的清除率发生改变。从图6(a)中发现，360 W超声波处理后，CASP- Zn的DPPH自由基清除率较其他超声波处理的强，0 W和480 W超声波处理的CASP- Zn的DPPH自由基清除率相接近。120 W和240 W超声波处理的CASP- Zn的DPPH自由基清除率相接近。从图6(b)中可以看出，不同超声波处理的CASP- Zn超氧阴离子自由基清除率变化不显著，其中，0 W超声波处理的CASP- Zn超氧阴离子自由基清除率较高。由图6(c)发现，经过240 W超声波处理的CASP- Zn的 H2O2清除率较强，但与其他超声波处理的CASP- Zn相比，H2O2清除率变化差异不大。这可能是因为短肽与锌离子螯合后，具有抗氧化活性的氨基酸结构发生改变，从而改变其抗氧化活性；而超声波处理改变短肽的结构，促进螯合反应，进而影响了锌离子与抗氧活性较强氨基酸的结合，从而使得CASP- Zn表现出不同的抗氧化活性。另外，360 W超声波处理后CASP- Zn具有较强的抗氧化活性，可能与其稳定的结构有关。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图6 超声波处理对CASP- Zn抗氧化性的影响Fig.6 Effect of ultrasonic treatment on antioxidant activity of CASP- Zn

3 结 论

1) 不同超声功率和超声时间对CASP- Zn的螯合率产生影响。通过比较发现，360 W超声波处理后的CASP- Zn螯合率最强，可以达到93.0%左右。另外，短时间(15 min)的超声处理就能使得CASP- Zn的螯合率达到较高值。

2) 光谱和电镜分析显示，经过超声波处理的CASP- Zn结构发生改变。这可能是因为超声波的空穴效应改变了短肽的结构，影响了短肽与锌离子的结合位点；也可能是超声波促进了螯合反应发生，增强了短肽与锌离子之间交联作用，从而使得肽- 锌复合物的结构发生改变。360 W超声波处理后的CASP- Zn结构变化最大，其结构也更稳定。

3) CASP- Zn具有抗氧化活性，经过超声波处理后，其抗氧化活性发生改变。360 W超声波处理后的CASP- Zn具有较强的DPPH自由基清除率，不同超声波处理的CASP- Zn对超氧阴离子自由基和H2O2的清除率变化不显著。

通过研究超声波处理对CASP- Zn螯合率、微观结构以及抗氧化活性的影响，发现超声波处理不仅能缩短反应时间，还提高肽- 锌复合物的稳定性及抗氧化性，有利于乌鳢资源的精深加工和开发利用。