昭通市5县区花魔芋蛋白质含量的测定

李 浪，张泽俊，张正彪，范贤林

（昭通学院 化学化工学院，云南 昭通 657000）

1 前言

魔芋（Konjac，为天南星科魔芋属多年生宿根性草本耐阴植物的地下块莲，学名为藤龍，又名鬼芋、花杆莲、天南星等，中药称蛇六谷）[1]。有学名的魔芋属种已有170 多种，块茎呈扁圆型、叶柄呈圆柱形、掌状复叶呈淡绿色多带有暗紫色斑点，株高40 至70 公分，生长于疏林下，开紫红色花，最早发现于斯里兰卡和印度。我国早在一千多年前就已经开始种植，在晋朝的《蜀都赋》中就有详细记载[2]。现主要生长在我国湖北、云南、四川等地，是我国的一种古典医药[3]。魔芋是一种药食两用的多年生草本植物，果实中含大量的葡甘聚糖及丰富的生物碱、黄酮、淀粉、神经酰胺、纤维素和矿物质等多种功能性成分，均具有明显的生物活性。魔芋果实具有多种特性其中包括高纤维、低蛋白、低脂肪、膨胀率高等，其药用功效方面还具有降三高、抗氧化、保健美容、抗癌解毒等多种疗效[4-6]，具有广阔的市场前景。

魔芋中的蛋白质是人体极为重要的营养物质，是生物体细胞组织构成的重要成分之一。蛋白质与人体的营养代谢、氧气运输、信息交流、细胞结构、增强免疫和遗传物质等相关[7]，具有构成机体、修复组织、构成酶和激素等活性物质、供给机体能量等生理功能，也是人体中氮的唯一来源，具有糖类和脂肪不可替代的作用[8]。目前而言，国内对昭通魔芋中各种有效成分提取分离所得的产品纯度还不高，使得魔芋的利用率不高造成资源浪费，没有实现真正意义上的综合利用。测定蛋白质含量的方法有经典的方法和先进的方法，其中经典的方法包括双缩脲试剂法、Folin-酚试剂法、紫外吸收测定法、考马斯亮蓝法等；先进的方法包括近红外光谱(Near Infrared Espectroscopy，简称NIR)分析技术、胶体金染色法、杜马斯燃烧法、流动注射分析法等[9]。双缩脲试剂法本身具有试剂单一、干扰物质较少、呈色性好、操作简单、准确性高等优点[10]，但灵敏度低需要把样品稀释至蛋白质浓度为1～10 mg/mL，这时测定结果较准确，所以本实验采用双缩脲试剂法作为首选测定方法[11,12]。本实验对昭通市5 个不同地区花魔芋中蛋白质含量测定的研究，为魔芋产品的附加值提供有价值的实验数据。

2 实验部分

2.1 实验材料

实验所用的花魔芋采自昭阳区、彝良县、大关县、镇雄县、永善县5 个地区。将花魔芋洗净后切片，置于40℃烘箱烘干，烘干后的魔芋经粉碎机粉碎后置于60 目，制得魔芋干粉，并于清洁干燥处放置，备用。

2.2 实验仪器设备与主要试剂

2.2.1 仪器设备

DFT-250A 手提式高速万能粉碎机（浙江温岭市林大机械有限公司）、EP64C 专业型分析天平（0.0001 g）（美国奥豪斯国际贸易有限公司）、HH-S24 数显恒温水浴锅（常州市金坛友联仪器研究所）、721 型可见分光光度计（山东高密彩虹分析仪器有限公司）、800 型离心沉淀器（上海手术器械厂）、DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海-恒科技有限公司）。

2.2.2 试剂

四氯化碳（天津市风船化学试剂科技有限公司）、酒石酸甲钠（成都化学试剂厂）、硫酸铜（天津市风船化学试剂科技有限公司）、碘化钾（广东光华化学厂有限公司）、氢氧化钠（天津市风船化学试剂科技有限公司）、牛血清蛋白（美仑生物化学试剂科技有限公司）以上药品均是分析纯。

双缩脲试剂A 液配制：将0.1250 mol 氢氧化钠放入100 mL 烧杯中溶解移入250 mL 容量瓶中定容，得0.5 mol/L 氢氧化钠溶液。B 液配制：将0.004 mol 硫酸铜（1 g）、0.0040 mol 碘化钾和2.5000 g 酒石酸甲钠依次加入100 mL 烧杯中溶解后移入250 mL 容量瓶中定容，得0.0160 mol/L 硫酸铜溶液。

0.0500 mol/L 氢氧化钠溶液：将0.0500 g 氢氧化钠放入100 mL 烧杯中溶解移入250 mL 容量瓶中定容备用。

5 mg/mL 的蛋白质标准液：准确称取0.2500 g牛血清蛋白于烧杯中用0.0500 mol/L 的氢氧化钠溶液溶解，移入50 mL 容量瓶中用0.0500 mol/L 的氢氧化钠溶液定容备用。

2.3 实验方法

在比较紫外吸收测定法、双缩脲试剂法、考马斯亮蓝法、Folin-酚试剂法四种方法测得蛋白质含量之间差异均不显著[12]。蛋白质中均含有碳、氢、氧、氮四种元素，其中含量最恒定的为氮元素，占16%左右[13]，蛋白质含有2 个以上肽键。在强碱性溶液中发生双缩脲反应，与硫酸铜形成紫色络合物，该络合物颜色深浅与蛋白质浓度成正比，所以根据氮元素的含量进行推算魔芋中蛋白质的含量。双缩脲试剂法能够有效地消除脂肪、糖类等物质的干扰，其精密度与准确度较高，有利于提高实验效率，值得进一步推广应用[14]。双缩脲法测定速度较快(约60 min)、对蛋白质呈色定性好、干扰物少、操作简便、不必提纯蛋白质，但灵敏度低需要把样品稀释至蛋白质浓度为1～10 mg/mL，这时测定结果较准确。双缩脲试剂法利用721 型分光光度计测定吸光度值，可直接测定蛋白质含量[15,16]因此作为本实验方法。

2.3.1 最大吸收波长

在10 mL 容量瓶中加入2 mL 含量为5 mg/mL的蛋白质标准液，再加入0.5 mL 蒸馏水，用7.5 mL 双缩脲试剂定容，摇匀静置5min。然后于721型分光光度计在波长370 至580 nm 下，每间隔10 nm 测定吸光度确定最大吸收波长范围，再以每间隔2 nm 测定吸光度确定最大吸收波长。以0 mL的标准液2.5 mL 蒸馏水7.5 mL 双缩脲试剂定容为空白试剂对照比色，多次实验选用最佳数据确定最大吸收波长。

2.3.2 单因素试验

为了确定魔芋蛋白质最佳测定工艺条件，研究了四氯化碳的量和测定温度对魔芋蛋白质的影响作用。

2.3.2.1 四氯化碳量的影响

用制得的魔芋干粉样品准确称取相当于25 mg蛋白质样品，转入5 个标记好的25 mL 容量瓶中，分别准确加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 四氯化碳，24.5、24、23.5、23.0、22.5 mL 双缩脲试剂定容。分别剧烈震荡10min 静置15min，用4000 r/min 的离心沉淀器离心5min 后取出清液。分别取4 mL清液于10 mL 容量瓶中用双缩脲试剂定容，以空白试剂对照比色，多次实验选用最佳数据确定加入四氯化碳的量。

2.3.2.2 温度的影响

用制得的魔芋干粉样品准确称取相当于25 mg 蛋白质样品转入锥形瓶，加入0.5 mL 四氯化碳24.5 mL 双缩脲试剂后放入数显恒温水浴锅中（从20℃至60℃每次升高5℃）剧烈震荡10min，静置15min，用4000 r/min 的离心沉淀器离心5min 后取出清液。分别取4 mL 清液于10 mL 容量瓶中用双缩脲试剂定容，以空白试剂对照比色，做多次实验选用最佳数据确定实验温度。

2.3.3 标准曲线制作方法

以牛血清蛋白制得的含量为5 mg/mL 的蛋白质溶液为标准样品制作标准曲线，用6 个10mL 的容量瓶做好标记分别加入标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，再分别加入2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL 蒸馏水，最后用7.5 mL 双缩脲试剂定容，摇匀静置5min 用721 型分光光度计在波长550 nm下以0 mL 的标准液容量瓶为空白对照比色，绘制标准曲线。

2.3.4 样品蛋白质含量测定

用制得的魔芋干粉样品准确称取相当于25 mg蛋白质样品，分别转入5 个标记好的25 mL 容量瓶中，加入上述最佳四氯化碳量，用双缩脲试剂定容。分别剧烈震荡10min 静置15min，用4000 r/min 的离心沉淀器离心5min 后取出清液，分别吸取4 mL 清液于10 mL 容量瓶中，按上述标准曲线的测定方法，测定实验样品的吸光度值，做三次平行实验计算样品中蛋白质的含量。

3 实验结果与讨论

3.1 最大吸收波长结果

按2.3.1 实验方法用721 型分光光度计在波长370 nm 至580 nm 下测定吸光度，实验结果表明波长540 nm 至560 nm 有最佳测定波长，实验结果如表1，由图1已知在550 nm 处为最佳测定波长。

表1 最大吸收波长结果Tab.1 Maximum absorption wavelength results

图1 最大吸收波长结果Fig.1 Maximum absorption wavelength result

3.2 标准曲线回归方程建立

按2.3.3 实验方法用721 型分光光度计在波长550 nm 下测定吸光度，结果如表2图2所示，以吸光度为横坐标，以蛋白质浓度为纵坐标，绘制出标准曲线。图2标准曲线的方程为：Y=8.29X +0.036，其中牛血清蛋白浓度(X)和吸光度(Y)的相关系数R2=0.9998 方程的线性良好可应用。

表2 标准曲线制作结果Tab.2 Standard curve production results

图2 标准曲线制作结果Fig.2 Standard curve production results

3.3 单因素试验结果

3.3.1 四氯化碳量的影响

按2.3.2.1 实验方法用721 型分光光度计在波长550 nm 下测定吸光度，实验结果如表3所示，由表已知四氯化碳最佳使用量1.5 mL。

表3 四氯化碳的量结果Tab.3 Results of the amount of carbon tetrachloride

3.3.2 温度的影响

按2.3.2.2 实验方法用721 型分光光度计在550 nm 波长、1.5 mL 四氯化碳条件下测定吸光度。如表4所示实验表明当温度达到60 ℃时蛋白质失去活性无法测定，温度在20 ℃至50 ℃范围双缩脲法对蛋白质产生的颜色反应影响较小可忽略不计[17]。

表4 温度的影响结果Tab.4 The effect of temperature

3.4 样品蛋白质含量测定结果

按2.3.4 实验方法用721 型分光光度计在波长为550 nm、室温、1.5 mL 四氯化碳条件下测定，结果显示：如表5所示不同地区魔芋中蛋白质的含量不同，昭阳区（2.04%）＞彝良县（2.02%）＞大关县（1.98%）＞镇雄县（1.72%）＞永善县（1.27%）。

表5 样品测定结果Tab.5 Sample measurement results

3.5 测定方法的检验

按标准曲线Y=8.29X + 0.036 回归方程计算所有的结果。

3.5.1 精密度实验

精密吸取标准溶液(5 mg/mL)0.5 mL 进行精密度实验，连续进行6 次测定其吸光度，如表6所示得RSD=4.6%，结果小于5%，实验结果表明精密度好。

表6 精密度实验结果Tab.6 Precision experiment results

3.5.2 稳定性实验

取同一样品溶液1 mL，每隔10 min 测定1 次，比较稳定性，实验结果如表7所示得RSD=1.2%，由表已知在显色60 min时间内吸光度稳定性较好。

表7 稳定性实验结果Tab.7 Stability experiment results

3.5.3 重现性实验

精密称取同一原料样品，多次配制每次取1 mL 样品液按样品测定方法，分别测定其吸光度，检验该测定方法的重现性，实验结果如表8所示得RSD=3.60%，结果小于5%，表明重复性较好。

表8 重现性实验结果Tab.8 Reproducibility experiment results

3.5.4 回收率实验

准确吸取已配制的1 mg/mL 样品溶液1 mL，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL蛋白质标准溶液，按上述样品测定方法分别测定其吸光度，计算回收率。实验结果如表9所示样品平均回收率均为114.96%，RSD 为4.95%，表明本法可行[18]。

表9 回收率实验Tab.9 Recovery rate experiment

4 结论

本研究选用昭通市花魔芋资源作为研究对象，对5 个不同地方花魔芋的蛋白质含量进行研究比较，用双缩脲试剂法对不同地区魔芋中蛋白质进行含量的测定，结果显示：不同地区魔芋中蛋白质的含量不同且昭阳区（2.04%）＞彝良县（2.02%）＞大关县（1.98%）＞镇雄县（1.72%）＞永善县（1.27%）。由实验已知双缩脲法在波长为550 nm下测定魔芋蛋白质时，当蛋白质浓度在1～10 mg/mL 范围内，线性关系比较好，变异系数小，重复性好，平均回收率和精密度都很高。该方法快速、准确、重现性和稳定性好，为快速测定植物中蛋白质成分含量提供了重要参考[19]双缩脲试剂法测定魔芋蛋白质含量所需时间少，操作简单，对环境无污染，是一种非常有前途的测定蛋白质的方法[20]。魔芋中蛋白质是人体极为重要的营养物质，是生物体细胞组织构成的重要成分之一。蛋白质含量的多少也是反映食品营养价值和用途的重要指标，同时也决定着食品的商业价值，因此实现对蛋白质含量的快速准确测定不仅是满足人们的营养需求，而且在一定程度上保障了消费者的合法权益。但目前由于技术水平的限制，蛋白质检测仪方法还需要进一步改进。探索药品仪器测定不同种类蛋白质的原理，实现高速、精确的技术检测体系，以满足人们对各种蛋白质的测定。