失荅剌知丸对动脉粥样硬化模型大鼠自噬因子Beclin1影响的研究＊

文/左艳丽，窦楠，李占涛，王娜琳，贾孟辉（.银川市第一人民医院；.宁夏医科大学）

本研究基于在基础水平的自噬可抑制AS 的发展进程。通过建立大鼠动脉粥样硬化模型，观察失荅剌知丸对自噬因子Beclin1 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组

SD大鼠，30只，雄性，SPF级，月龄2月，体质量（300±20）g，由宁夏医科大学实验动物中心提供。30 只大鼠随机分为模型组、阿托伐他汀组、失荅剌知丸组，每组10 只。

1.1.2 药品

失荅剌知丸，柴胡31g、黑诃子31g、芦荟62g、失荅剌知（元胡）6g、菖蒲6g、番盐6g、沙哈木罕荅里（药西瓜）9g、阿里公（松蕈）9g、安息香9g、撒额冰（阿魏）9g、干姜9g、荜茇9g、胡椒9g、白芥子9g、芸香9g、巴豆霜9g。方中除巴豆霜、安息香、阿魏三味药物，余均在凉水浸泡60min 后，使用TC-15 套式恒温器220V 电压加热煎煮；巴豆霜9g（先煎），安息香9g、阿魏9g（后下），沸腾后调低电压，保持微沸状态煎煮30min，滤取煎液；药渣再加入凉水浸泡30min 后煎煮，方法同前，滤取煎液；合并两次煎液，将药液于恒温水浴锅（100℃）内浓缩至111.11ml，浓度为2.088g/m1，4℃保存备用。

维生素D3：（ 瑞 士，DSM Nutritional Products Ltd.，注册证号：H20090622）。

阿托伐他汀钙（辉瑞制药有限公司，生产批号：CJ7029）。

1.1.3 主要实验试剂

兔抗大鼠Beclin1 抗体：博士德生物公司。

浓缩型正常山羊血清：博士德生物公司。

1.1.4 主要仪器

FX4-2 型电热恒温干燥箱：Shella 公司。

1.2 方法

造模与给药：30 只大鼠均饲以高脂饲料（由2%胆固醇、5%猪油、10%蛋黄粉、83%基础饲料组成）复制大鼠AS 模型，于实验开始当日一次腹腔注射维生素D3315万U/kg，共计12 周。造模开始6 周、10 周、12 周后随机处死1 只大鼠检验造模情况，检测主动脉弹性下降、内膜增厚、肉眼可见脂质斑块，为造模成功。采用随机数字表法，随机分为3 组，其中模型组10 只，失荅剌知丸组10 只，阿托伐他汀组10 只。按上述分组灌胃给药，给药容积为100g/ml（灌胃容积为100g/ml，失荅剌知丸每日给予2 次灌胃，阿托伐他汀给予每日一次灌胃），连续给药8 周。

2 观察指标

免疫组化法检测Becilin1：Beclin1 主要在腺上皮和间质细胞的细胞浆中表达。大鼠麻醉后,取出动脉，进行冲洗、包埋，切片，加入I 抗、II 抗，DAB 显色，放于显微镜下观察，细胞浆中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。观察每张切片随机选择3 个观察区域，根据细胞的染色程度和显色深浅，以及阳性细胞所占的百分比率进行计分。显色程度评分标准：细胞不显色为0 分；细胞显色为黄色记为1 分；细胞显色为棕黄色记为2分；细胞显色为深棕色记为3分；阳性细胞所占百分比率评分标准：无显色的细胞为0%记为0 分；显色细胞≤30%记为1 分；显色细胞30%-50%记为2 分；显色细胞>50%记为3 分。将两次评分结果相加；0-1 分记为阴性（-），2-4 分记为阳性（+），5-6 分记为强阳性（++）。

3 统计学方法

采用SPSS19.0 软件进行统计。计数资料以率（%）表示，之间比较采用卡方x2检验，结果以均数±标准差（±s）表示。显著性水准取α ＝0.05。

4 结果

免疫法检测自噬相关蛋白Beclin1：Beclin1 在模型组、阿托伐他汀组、失荅剌知丸组的阳性表达率分别为20%、60%、90%。其中，与模型组相比，失荅剌知丸组Beclin1 阳性表达率增加更显著（x2=9.90,P<0.05）。见表1。

表1 失荅剌知丸对动脉粥样硬化性大鼠Beclin1表达的影响

5 讨论

AS 的发生是很多心脑血管疾病发生的基础，AS 的形成是一个时间持续较长的过程，在AS 发生的初期，动脉粥样硬化斑块内的自噬细胞可通过自身调节减少泡沫细胞的聚集，减缓动脉粥样硬化的进程。

Beclin1 是第一个被确认的哺乳动物的自噬基因，是自体吞噬发生的重要起始因子[1]，也是形成自噬体的必须分子[2]，其表达量的多少在一定程度上也反映着自噬的活性程度。

动脉粥样硬化在中医学中无统一命名，可属于“胸痹”、“中风”等范畴。中医认为，气虚为本，痰瘀等致病因素互结，导致瘀阻脉络，气血运行不畅而致。因此，以辛香温通、截痰开结、逐水破瘀为治则。失荅剌知丸运用多种辛温药物，菖蒲、药西瓜、松蕈、安息香、阿魏、干姜、荜茇、胡椒、白芥子以温煦体内阳气，以祛湿散寒；运用柴胡、元胡以理气止痛，芦荟、巴豆霜化瘀、逐痰，以达辛香温通、截痰开结、逐水破瘀之效。

在本实验中，免疫组化结果显示，失荅剌知丸组的Beclin1 阳性表达率增加显著，这可能是该方抗动脉粥样硬化的重要作用机制。