透明质酸锌抑菌防腐效果的试验检测结果对比

王耀华 刘家栋 王梓诺 庄 洁 唐毓萍 黄天怿 赵 毅

（华熙生物科技股份有限公司上海研发中心 上海 200120）

1 前言

透明质酸是由葡萄糖醛酸和氨基葡糖双糖重复单位组成的多糖。透明质酸锌是透明质酸的锌盐，通过锌离子与透明质酸钠羧基上的钠离子进行离子交换制得[1]。 有研究表明，透明质酸锌具有抗微生物、抗氧化损伤等作用，目前在医疗领域应用较广泛，如制成凝胶等剂型，作为伤口敷料用于皮肤和眼外科，可促进创面自然愈合[2]。 透明质酸作为优质的保湿原料在化妆品中应用极其广泛，而透明质酸锌同样具有保湿的功效。 透明质酸锌的抗微生物特性使其可作为具有抑菌防腐效能的活性原料。 为了解不同分子量透明质酸锌的抑菌作用，本文采用防腐剂挑战试验方法对其抑菌防腐效果进行研究。

2 材料及方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验样品

3 种分子量的浓度为0.5%透明质酸锌水溶液：低分子量10 KDa、中分子量200～400 KDa、高分子量500～1 000 KDa。

2.1.2 试验菌株和培养基

菌株：大肠杆菌（ATCC8739）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、铜绿假单胞菌（ATCC9027）、表皮葡萄球菌（ATCC12228）、白色念珠菌（ATCC10231）、黑曲霉菌（ATCC16404）（广东省微生物菌种保藏中心）。

培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）（美国BD 公司）；D/E 中和肉汤（青岛海博生物技术有限公司）。

2.1.3 主要仪器

菌落计数器（scan100，法国interscience 公司）；高压蒸汽灭菌器（MLS-3781L-PC，日本PHcbi 公司）；生物安全柜（1300 系列II 级A2 型，美国赛默飞公司）；生化培养箱（BD720&KB400，德国BINDER 公司）。

2.2 试验方法

防腐剂挑战试验参考美国药典USP35＜51＞“抗菌效能实验方法”[3]进行，单次分别接种一定量的菌种于被测样品中，然后定期量取一部分被测样品至培养基中培养测试，并统计计算菌种的后续生长情况。

2.2.1 菌液制备

取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌及白色念珠菌的新鲜培养物，用10 mL无菌生理盐水洗下菌苔，并将其稀释成含菌量为1×107～1×108cfu/mL 的菌悬液。

黑曲霉菌：用含有0.05%吐温80 的生理盐水洗下斜面上的菌落及孢子，用无菌棉纱布或尼龙网过滤洗下的菌液，滤液于3 500（±10%）r/min 的速度下离心约20 min，弃去上层溶液，加生理盐水溶解沉淀后的孢子用作接种用菌悬液，菌悬液的浓度控制在1×107～1×108cfu/mL。

2.2.2 试验步骤

样品微生物检测：以无菌操作技术在生物安全柜中用灭菌玻棒或无菌接种环蘸取少许透明质酸锌样品划线于TSA 及SDA 上，将TSA 平板在（32.5±2.5）℃生化培养箱中培养3～5 d，SDA 平板在（22.5±2.5）℃生化培养箱中培养5～7 d 后观察结果。如有微生物生长，则该批样品不能用于防腐剂挑战试验。

分别吸取20 mL 透明质酸锌样品至无菌瓶中，每种分子量的透明质酸锌样品各准备6 瓶。 于旋涡振荡器上振荡菌悬液试管约15 s，然后在含20 mL 样品的无菌瓶中接种0.2 mL 菌悬液，使样品中的最终含菌量为1×105～1×106cfu/mL，每种试验菌悬液各接种1 瓶样品。

样品接种后立即充分混合约1min，确保混合均匀。

测试期间已接种的样品应放置在20℃～25℃的环境中保存。

分别于接种后2、7、14、28 d 时进行取样回收测定活菌数，取1.0 mL 接种样品加入9 mL D/E 中和肉汤中，用D/E 中和肉汤进行1∶10 连续稀释，稀释完成后浇板测定活菌数，细菌浇TSA 在（32.5±2.5）℃培养3～5 d，酵母菌和霉菌浇SDA 在（22.5±2.5）℃培养5～7 d。

计算挑战试验控制计数（起始点每毫升样品的接种浓度）的log 值与不同时间点残存计数（测试时间点每毫升样品的回收值）的log 值，二者相减即为每个取样时间点的log 减少值，详见表1。

表1 USP-35＜51＞参考标准：log 减少值要求a

3 试验结果

不同分子量透明质酸锌水溶液的防腐挑战试验结果详见表2、表3、表4。

由表2、表3、表4 试验结果可知：3 种不同分子量的透明质酸锌水溶液，浓度为0.5%时，防腐挑战试验结果最终都能达到USP-35＜51＞的要求（表1）。

通过接种后2 d 得到的试验结果可以看出，透明质酸锌的分子量越高，其对部分细菌及白色酵母菌的抑菌能力就越强。

表2 0.5%低分子量(10 KDa)透明质酸锌防腐挑战试验结果

表3 0.5%中分子量（200～400 KDa）透明质酸锌防腐挑战试验结果

表4 0.5%高分子量（500～1 000 KDa）透明质酸锌防腐挑战试验结果

在透明质酸锌持续作用下，14 d 时3 种分子量透明质酸锌水溶液中的4 种细菌和白色念珠菌数量均减少至＜10 cfu/mL，相应的log 减少值均达到最大值。 这个试验结果充分证明透明质酸锌水溶液对于这4 种细菌和白色念珠菌有较强的抑菌防腐效能。

不同分子量的透明质酸锌水溶液对于黑曲霉菌的抑制能力大致相当，仅能控制黑曲霉菌的数量不再增加，却无法像灭菌那样使黑曲霉菌的数量大幅减少[4]。

4 讨论

以上试验结果证明浓度为0.5%的透明质酸锌具有抑菌防腐效能，可以作为一款具有自身防腐功效的多功能活性物应用在化妆品配方中。 如果产品包装形式恰当且产品生产过程符合生产质量管理规范（GMP），产品配方构建时可以考虑不添加常规防腐剂，仅靠透明质酸锌的自身防腐功能就能保证产品从生产、销售使用的全生命周期免受微生物污染[5]。 如果产品的生产过程GMP 欠缺，包装形式、使用方式也存在二次污染的可能，那么可以将透明质酸锌与具有防腐功效尤其是具有高效抑制霉菌功效的其他成分复配增效，共同构建一个更加强力的防腐体系，以达到防止微生物污染的目的。