HPLC 法测定久芝清心丸中黄芩苷的含量

钟东玲 卢小燕 蔡丹燕 邱姗姗

（茂名市食品药品检验所 广东茂名 525000）

1 前言

久芝清心丸收载于卫生部颁药品标准（中药成方制剂第七册第九页）[1]，具有泻火、清热、通便的作用。本品中的黄芩有清热燥湿、止血、泻火解毒、安胎等功效[2，3]。 现行久芝清心丸的部颁标准较为简单，仅提供显微鉴别和冰片、大黄的薄层色谱鉴别。为了保证药品的安全有效，对其质量标准进行更深层次的研究，本试验采用高效液相色谱法对本药品中黄芩的有效成分黄芩苷的含量进行测定。

2 材料和仪器

材料：供试品久芝清心丸（批号1014847、1014840、1014844）；对照品黄芩苷（中国食品药品检定研究院，批号110715-201318，含量93.3%）；甲醇（色谱纯）；磷酸（分析纯）；蒸馏水。

仪器：LC-2010CHT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；XS205 电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），KQ-300VDE 型双频数控超声波清洗器（昆明市超声仪器有限公司）。

3 方法与结果

3.1 系统适应性试验

色谱柱：RP-18 endcapped（5 μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；流速：1.0 mL/min；检测波长：277 nm；柱温：30℃；泵压不大于25 MPa；定量方法：外标法；进样量：10 μL。在此条件下，理论板数按黄芩苷计算不少于2 000，分离度大于1.5，详见图1～图3。

图1 黄芩苷对照品的液相色谱图

图2 久芝清心丸供试品的液相色谱图

由图1、图2 和图3 可知，供试品和对照品溶液在相同的保留时间处出现对应的峰，并且能达到基线分离；黄芩阴性对照品溶液在对应的保留时间处无吸收峰，表明其他味药对黄芩苷的测定无干扰，该方法专属性较好。

3.2 供试品溶液的制备

取大蜜丸适量，剪碎，混合均匀，精密称定0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加入50 mL 70%乙醇，称定重量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，取出，放冷，再精密称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液5 mL 置于25 mL 量瓶中，加70%乙醇稀释到刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得。

3.3 对照品溶液的制备

精密称定黄芩苷对照品（批号：110715-201318）10.46 mg（含量为93.3%），置于100 mL 容量瓶中，加入甲醇至容量瓶刻度，摇匀，即制得含量为97.59μg/mL的黄芩苷对照品贮备液，精密量取贮备液2 mL 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（每1 mL中含黄芩苷19.52 μg）溶液。

3.4 阴性样品溶液的制备

按久芝清心丸中处方比例，取除了黄芩外的其他10 味药材，用打粉机粉碎成细粉，过筛，充分混合均匀，再按3.3 项下提供的方法制成阴性溶液。

3.5 线性关系考察

图3 黄芩阴性对照品的液相色谱图

精密量取黄芩苷对照品贮备液97.59 μg/mL，按照0、1、5、10、20、50 倍的比例[4]分别稀释成一系列不同浓度的对照品溶液，充分摇匀，即制得6 个不同浓度（0.097 59、0.048 80、0.019 52、0.009 76、0.004 88、0.001 95 μg/μL）的对照品溶液，分别进样10 μL 进行测定，并以对照品的浓度（μg/μL）为纵坐标，测得的峰面积为横坐标，进行回归处理。

以黄芩苷对照品测得的峰面积值（y）作为纵坐标，黄芩苷对照品的浓度作为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：y=37574x-22687，相关系数r=0.999 9（n=6）。 结果表明，黄芩苷的进样量控制在0.001 95～0.097 59 μg 内与峰面积呈现良好线性关系，说明符合外标法定量测定的要求。

3.6 仪器精密度试验

取相同浓度（0.019 52 mg/mL）的对照品溶液，按照拟定的色谱条件连续进行进样6 次，进而测定并记录黄芩苷的峰面积。 根据药典含量测定方法学验证中的精密度试验，规定相对标准偏差（RSD）不得大于3%[5]，实际测得结果的RSD=0.76%（n=6），结果显示其精密度良好。

3.7 重复性试验

取6 份同一批号的供试品溶液，在相同色谱条件下测定，结果显示黄芩苷的平均含量为7.825 6 mg/g，且在7.7850～7.879 0 mg/g 内，其RSD=0.53%，表明相对标准偏差较小有良好的重复性。

3.8 稳定性试验

在相同的色谱条件下，对同一供试品在不同时间段进行含量测定，即0、2、4、8、12、16 h 分别开始进样，结果表明含量的RSD=1.16%（n=6），表明在16 h 内供试品溶液中黄芩苷的含量能基本维持稳定。

3.9 加样回收率试验

为了检验所建立的含量测定方法对供试品溶液的含量测定是否有影响，取同一批号相同浓度的供试品溶液进行6 次回收率试验。 对照品加入量中的黄芩苷的含量和样品中的黄芩苷的含量之和在规定的标准曲线线性范围之内，结果显示6 次同一供试品溶液中测得的黄芩苷含量的平均回收率为99.88%，RSD=0.76%，测得结果在规定的平均回收率95%～105%内，表明该方法切实可行，详见表1。

表1 加样回收试验结果

3.10 样品含量测定

取3 个批号的样品（1014847，1014840，1014844），按拟定的色谱条件进行含量测定，结果表明3 个批号的久芝清心丸中黄芩苷的含量略有不同，但是其RSD 都较小，表明该方法稳定可行，详见表2。

表2 久芝清心丸含量测定结果

4 讨论

4.1 提取方法的选择

分别尝试用70%乙醇加热回流提取、70%乙醇超声提取，结果表明本品用70%乙醇超声提取方法简便且提取完全。

4.2 流动相的选择

参考《中国药典》2010 年版一部黄芩药材中的黄芩苷含量测定采用的流动相比例为甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2），后来调整流动相比例为甲醇-水-磷酸（45∶55∶0.2），发现其保留时间较长，而且黄芩苷的液相色谱峰形较差，拖尾因子大，因此改用甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）为流动相，更适合测定久芝清心丸中黄芩苷的含量，拖尾因子小，检测目标峰可达到基线分离。

5 结论

经过试验，采用RP-18 endcapped（5 μm）为色谱柱，甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）为流动相，用277 nm作为检测波长测定久芝清心丸中黄芩苷的含量，黄芩苷浓度呈现良好的线性关系。而且其稳定性、重现性、精密度试验也呈现良好结果，黄芩苷液相色谱的峰与邻峰的分离效果较好，且提取供试品方法仅为超声提取，方法快捷简便，表明该方法可以在日后的生产及流通过程中控制久芝清心丸的质量并提供参考价值。