高效液相色谱法测定禽蛋中胆固醇的含量

刘阿静 虎惠媛 彭嬿雯 张红艳 王慧珺 王 波 伏庆红

（1.兰州海关技术中心 甘肃兰州 730010；2.甘肃农业大学食品科学与工程学院；3.甘肃泛植制药有限公司）

1 前言

胆固醇是人体内不可或缺的一种重要物质，主要参与细胞膜、多种激素、胆汁酸及维生素D 的合成，其含量直接影响人体的健康状况，过高会导致动脉硬化并诱发一些综合并发症，过低易导致血管壁脆性增加，导致人体免疫力和应急能力降低[1-4]。 因此，控制饮食中摄入的胆固醇量尤为重要，通常人体摄入胆固醇的来源主要为禽蛋类和肉类，而胆固醇是影响禽蛋品质的一项重要指标。

据文献报道禽蛋中胆固醇的测定方法主要有试剂盒法、比色法、高效液相色谱法（HPLC）等[5-8]。试剂盒法和比色法操作步骤烦琐，试验干扰较大，结果准确性不高，而HPLC 分离效能强，特异性强，准确度高，相关报道的文章不多。 笔者在前人研究的基础上，通过改进试验皂化方法，研究出了针对禽蛋中胆固醇含量分析的测定技术，可以准确定量禽蛋中的胆固醇，为保障人体健康提供一定的技术支撑。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

仪器：Waters 2695 高效液相色谱仪，配置紫外检测器（美国Waters 公司）；电子天平（±0.1 mg，德国Sartorius 公司）；均质机（VCX750，美国SONICS 公司）。

试剂：胆固醇（200 μg/mL，色谱纯，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司）；氢氧化钾；无水硫酸钠；无水乙醇；石油醚（沸程30℃～60℃）；无水乙醚（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；蒸馏水；禽蛋样品。

2.2 试验方法

2.2.1 色谱条件

色谱柱：SVER-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇；检测波长：205 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样量：10 μL。

2.2.2 标准溶液配制

分别准确移取胆固醇标准溶液5、2.5、1.25、0.25、0.125、0.050、0.025 mL 于5 mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容，配制成浓度为200、100、50、10、5、2、1 μg/mL 的标准系列浓度工作液，置于4℃条件下冷藏待用。

2.2.3 样品处理

参考GB 5009.128—2016 《食品安全国家标准食品中胆固醇的测定》[9]中第二法略作修改。 取每种禽蛋5 枚去皮，匀浆机搅拌均匀。称取制备后的全蛋样品1.0 g（精确至0.001 g）于250 mL 圆底烧瓶（加入适量沸石）中，随后参照GB 5009.128—2016 中方法进行皂化，皂化结束后，室温冷却30 min 后提取。提取液经无水硫酸钠脱水转移到玻璃离心管中，提取液氮吹至近干，最终用甲醇溶解并定容至50 mL，过0.45 μm 有机滤膜，待测。

3 结果与讨论

3.1 色谱柱的选择

试验选择3 款固定相差异明显的色谱柱进行筛选，分别为色谱柱SVER-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、CR1:4（150mm×4.6mm，5μm）和MGII（150mm×4.6mm，5 μm），结果见图1～图3。色谱柱SVER-C18 和CR1:4对胆固醇的分离能力均较好，峰型尖锐，整个试验分离过程基线平稳，能实现快速有效的分离，而CR1:4色谱柱中胆固醇出峰时间相对较晚；色谱柱MGII虽然能对胆固醇进行分离，但是峰型较宽，不利于目标物的定性和定量。 从检测成本及普适性方面综合考虑，试验最终选取SVER-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱分离测定禽蛋中胆固醇。

3.2 样品皂化冷却后放置时间的优化

本试验分别对样品经加热皂化后冷却至室温提取的放置时长10、20、30、40、50、60 min 进行了考察。通过回收率试验可知，胆固醇含量随着放置时长的增加而增大，当放置时长为30 min 时，胆固醇含量达到最大值，随着放置时长的延长，胆固醇含量几乎保持不变。因此，皂化冷却后的样品溶液应至少放置30 min 后提取效果更佳。

3.3 方法学考察

3.3.1 标准曲线绘制

在优化的最佳色谱条件下，取配制的标准系列工作溶液进行测定分析， 以胆固醇标准系列峰面积对应标准工作液的浓度进行线性拟合，回归方程为Y=6.27×103X-7.11×103，相关系数R2=0.999 3。 结果表明，方法在1～200 mg/L 内线性关系良好，该方法的检出限（S/N=3）为0.5 mg/L，定量限（S/N=10）为1.67 mg/L。

图1 SVER-C18 色谱柱对禽蛋中胆固醇分离效果的影响

图2 CR1:4 色谱柱对禽蛋中胆固醇分离效果的影响

图3 MGII 色谱柱对禽蛋中胆固醇分离效果的影响

3.3.2 精密度和加标回收率

在样品1#（胆固醇含量为272.29 mg/100 g）中分别添加高、中、低3 个不同浓度的胆固醇标准溶液，充分涡旋混合均匀，按照“2.2.3”进行样品处理，“2.2.1”分析测试，重复测定6 次。 具体分析结果详见表1。由表1 可知，不同浓度添加水平下，平均加标回收率在91.04%～96.88%，相对标准偏差（RSD）在1.21%～1.90%，表明HPLC 测定禽蛋中胆固醇的分析方法准确度高，重复性和精密度良好。

3.4 实际样品测定

根据试验优化的最佳条件以“2.2.3”进行样品处理，按照“2.2.1”色谱条件分别对多种不同类禽蛋进行分析测试，并与胆固醇标准物质保留时间对照定性，采用外标法定量，样品色谱图详见图4，具体结果详见表2。 结果显示，在优化的最佳试验条件下，标准品及样品均能得到很好的分离，表明该方法适用于不同禽蛋中胆固醇的测定。

表1 回收率试验结果（n=6）

图4 样品中胆固醇色谱图

表2 不同禽蛋样品中胆固醇含量测定

4 结论

本文通过对色谱条件、样品皂化后冷却时长、方法学的考察和优化，建立了高效液相色谱分析检测不同类禽蛋中胆固醇含量的测试方法，该方法操作简便、重复性和稳定性良好，准确度高，回收率符合试验要求，为实际检测禽蛋样品中胆固醇提供了规范、有效的技术支持，也为其他样品中胆固醇的检测奠定一定的技术基础。