啤酒中4-乙烯基丁香酚的研究进展

杜俊杰，崔云前*，吉春晖，孟 飞，周长生

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院山东省微生物工程重点实验室，山东济南 250353；2.菏泽巨鑫源食品有限公司，山东菏泽 274400）

在啤酒的活性风味物质中，已检测出了挥发性酚、愈创木酚、苯酚、香草醛、乙酰香草酮、丁香酚、4-乙烯基丁香酚（4-vinylsyringol，4-VS）、4-乙烯基愈创木酚（4-vinylguaiacol，4-VG）、4-乙烯基苯酚（4-vinylphenol，4-VP）等。大多简单的酚类化合物来源于酿造过程中的原料或受污染的发酵液（如氯酚），仅有某几种是酵母代谢产生的。“酚的不良风味（phenolic off-flavour，POF）”术语常用于描述啤酒具有强烈的药味和丁香花味。4-乙烯基丁香酚（4-VS）是一种具有“烟熏味”和“烟草味”类似于老化啤酒风味的酚类物质，主要由芥子酸（sinapic acid，SA）脱羧生成。在下面发酵啤酒中，4-VS被称之为“异酚味”，不受消费者所喜欢，但在比利时白啤酒、德国小麦啤酒和烟熏啤酒等上面发酵啤酒中，4-VS却是一种对啤酒酒体全面评价必不可少的风味物质。因此，对啤酒中4-VS的研究就尤为重要。目前国内外对4-VS的研究不多，因此本文对4-VS近几年来主要的几个研究成果进行综述，重点介绍4-VS的形成途径，老化风味的鉴定以及抗氧化活性，为以后啤酒中4-VS的深入研究提出一些建议。

1 4-乙烯基丁香酚在啤酒中的形成途径

酚类在啤酒中多以单体或者是聚合物的形式存在。酚酸则是啤酒中单酚的一种，酚酸是一类简单的单环酸，包括苯甲酸和肉桂酸的羟基衍生物等。从啤酒中可以检测出来大约有20种不同的肉桂酸（如p-香豆酸、阿魏酸、芥子酸、咖啡酸）和苯甲酸（如香草酸、没食子酸、丁香酸）的羟基衍物[2]。尤其是羟基肉桂酸（hydroxycinnamic acids，HCA）如p-香豆酸、阿魏酸以及芥子酸与植物细胞壁中的多聚糖有关。在谷物中，这些羟基肉桂酸主要与阿拉伯木聚糖（arabinoxylans，AX）发生酯化作用。谷物谷皮、果皮、糊粉层和胚乳细胞中阿拉伯木聚糖是其形成碳水化合物的重要结构，AX由β-（1-4）-木聚糖组成，木糖残基在C2/C3位上被树胶醛醣取代。肉桂（3-苯基丙稀酰）基团会吸附在阿糖呋喃残基的O5位上。AX是一种高分子质量部分水溶性聚合物。在酿造过程中，这些羟基肉桂酸均会被AX水解酶从麦芽中萃取和溶解进入麦汁中[3]。

4-VS的前体物质芥子酸是一种小分子天然存在的羟基肉桂酸，羟基肉桂酸属具有生物活性的酚酸类，主要包括咖啡酸、阿魏酸、芥子酸等，这些化合物的氧基氢原子与人体内有害的氧自由基中和[4]。芥子酸是4种最常见的羟基肉桂酸之一，许多研究者认为芥子酸是一种有效的抗氧化剂，其功效被认为优于阿魏酸。而阿魏酸是一种已被用作食品、饮料和化妆品中天然抗氧化剂（3甲氧基-4-羟基肉桂酸），可与咖啡酸媲美[5]。近年来，芥子酸及其衍生物因其具有多种生物活性而引起人们的广泛关注。芥子酸具有抗菌、抗炎、抗癌和抗焦虑的作用。芥子酸的脱羧产物4-VS在清除自由基、抑制脂质过氧化、抗菌、抗癌和消炎方面都有一定的功效，此外4-VS还是效的抗突变药物，是一种乙酰胆碱酯酶抑制剂，可用于老年痴呆症、共济失调、重症肌无力和帕金森病的治疗[6]。

在啤酒酿造过程中，芥子酸主要来自一些原料和辅料当中。BONDIA-PONS I等[7]研究发现，在黑麦中，芥子酸可以占所有酚酸的9%～10%；HUDSON E A等[8]研究报道，在酿造辅料大米中，芥子酸的含量为1.05（μg/g干质量）；MATTILLA P等[9]研究发现，在另一种酿造辅料燕麦中，芥子酸的含量为56.05（μg/g干质量）。OSORIO C等[10]还提到当啤酒中添加萨兹酒花时，芥子酸的含量会有所提升。与p-香豆酸和阿魏酸相同，在啤酒酿造过程中芥子酸先是通过阿糖呋喃酯酶的作用释放出游离酸，通过不同的途径脱羧进而形成风味活性挥发性物质酚类4-VS。类似与p-香豆酸和阿魏酸脱羧形成4-VP和4-VG的途径，芥子酸脱羧形成4-VS的途径主要有两种：①通过啤酒酿造过程的高温热反应产生（如麦汁煮沸、旋涡沉淀和巴氏杀菌等）；②通过发酵过程中酶的脱羧反应，主要是通过上面发酵酵母菌株苯基丙烯酸脱羧酶（phenylacrylic acid decarboxylase，PAD）l的作用以及一些其他的芥子酸脱羧酶，或污染了微生物（如大肠杆菌、乳酸菌、醋酸菌和一些酒香酵母、德克酵母等野生酵母）[11]。除此之外，挥发性4-VS会在贮藏啤酒老化过程中增加，很可能来自于配糖类化合物的酸水解或是芥子酸的热脱羧反应[12]。

2 自然老化啤酒中4-乙烯基丁香酚的鉴定

到目前为止，对于4-VS的研究大都聚焦在啤酒老化方面。长期以来，啤酒老化一直是啤酒厂研究的重点。最近几年，许多研究者在自然老化啤酒中鉴定出来4-VS这种挥发性酚类物质。CHEVANCE F等[13]利用自然老化啤酒的香气提取稀释分析（aroma extract dilution analysis，AEDA），通过气相色谱分析，在不同的固定相中的保留指数（retention index，RI）（二甲基聚硅氧烷气相色谱柱保留指数）=1 532和聚乙二醇气相色谱柱保留指数=2 809处发现了一种类似老化啤酒的气味，其荧光检测（fluorescence detection，FD）值接近反式-2-壬烯醛（反式-2-壬烯醛，老化啤酒中常见的硬纸板异味）。并利用特定的酚萃取、气相色谱冷阱和质谱分析（电子冲击和化学电离）最终确定是4-乙烯基丁香酚（4-VS）。LERMUSIEAU G等[14]为了人为地提高XAD-2啤酒提取物中未知物的水平，首次在40 ℃条件下将拉格啤酒加速老化10 d，用气相色谱方法进一步浓缩该化合物。洗脱液从气相色谱保留指数RI=1 509至RI=1 563转移到冷阱中，经过30次气相色谱注射后，利用二乙醚洗脱这一冷阱，回收一种具有很“酚醛-烟草-老化啤酒”气味的萃取物。在极性聚乙二醇色谱柱上测定该化合物的保留指数RI为2 809。通过对酚类化合物应用特定的提取程序来回收未知物，表明其酸度系数（pKa）值在9～13范围内。通过气相色谱-质谱联用分析，进一步证实了酚结构，通过化学电离甲烷（CH4）-一氧化二氮（N2O）（75∶25，V/V），获得分子质量为181的假分子离子，稳定的分子离子（180 m/z）与芳香环一致，然而，未知的特征还包括失去甲基自由基（165 m/z），而不是的酚醛甲基酮。因此，最终确定所得到的未知物的结构为3,5-二甲氧基-4-羟基苯乙烯。商品化的3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸（芥子酸）的脱羧反应进一步鉴定了3,5-二甲氧基-4-羟基苯乙烯是4-乙烯丁香酚（4-VS）。ULLRICH F等[15]为了确定啤酒老化的潜在关键风味，使用比利时商业啤酒在20 ℃条件下自然贮藏3月或6月。在气相色谱-嗅闻（gaschromatographyolfactometric，GC-O）技术分析之前，用AmberliteXAD-2树脂提取啤酒，以这种方式获得的最具代表性的样品被进一步用香气提取物稀释分析（AEDA）。通过用AEDA方法老化啤酒进行检测，4-乙烯基丁香酚被鉴定为一种强烈的牙医味、烟熏味的老化啤酒酚醛味（FD值与反式-2-壬烯醛一样高，导致老化啤酒中的纸板异味）[16]。因此，4-乙烯基丁香酚这样的低分子质量酚类物质能使老化啤酒产生异味。

3 4-乙烯基丁香酚的最新研究

芥子酸及其衍生物，特别是4-VS都有很强的抗氧化活性的特性[17]。甚至4-VS的抗氧化活性比芥子酸还要高，且具有抗诱变等生理活性[18]。4-VS除了是一种强效的抗氧化剂之外还是一种抗诱变剂，同时也有抑制癌变和炎性细胞因子的诱导的作用[19]。因此，国内外对4-VS的抗氧化能力与生理活性进行了许多研究。HARBAUM-PIAYDA B等[20]研究发现，4-VS特别是芥子酸可显著抑制乳状液的氧化；WAKAMATSU D等[21]研究发现，4-VS要比已知的抗氧化剂α-生育酚、维生素C、β-胡萝卜素、槲皮等相比抗烷基过氧自由基（ROO·）更强。TERPINC P等[22]较为系统地评价了4种羟基肉桂酸，包括阿魏酸、p-香豆酸、咖啡酸和芥子酸及其芥子酸的脱羧衍生物4-VS的还原能力与过氧自由基（ROO·）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧阴离子自由基的清除能力，结果表明，在均匀的极性介质中，上述羟基肉桂酸脱羧衍生物4-VS的抗氧化活性低于它们本身，而在乳液体系中，脱羧衍生物4-VS则表现出了更高的抗氧化活性。除具有强的抗氧化活性外，4-VS还具有抗诱变、消炎、抗癌等生理活性。KUWAHARAH等[23]研究表明，4-VS对内源性诱变剂过氧化亚硝酸盐表现出有效的抗诱变能力，甚至比α-生育酚、黄酮类化合物还要好，与Ebselen（中枢神经系统药，具有解热镇痛及抗痛风的功效）相当。GALANO A等[24]给蒙古沙鼠饲喂4-VS，结果表明，4-VS具有显著抑制幽门螺杆菌以及由此引起的胃炎和胃癌的发生。JIANG J等[25]研究表明，4-VS具有显著保护人体视网膜色素上皮细胞免受过氧化氢诱导氧化损伤的作用，从而可能对与年龄相关的黄斑变性和其他氧化应激相关的视网膜疾病有治疗作用。由于氧化应激与多种疾病如癌症、心血管疾病、机能失调、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病等有关，因此，4-VS所具有的能对抗氧化应激的功能将使其成为一种极有希望的化学药物。

其次，在寻找可以使芥子酸脱羧生成4-VS的脱羧酶方面，也有大量的研究报道。有报道称[26]，当采用一株高苯基丙烯酸脱羧酶（PAD）l活性的上面酵母菌株时，芥子酸也能成为啤酒中含量最丰富的酚酸；为了深入了解酵母PADl活性的分类情况，筛选了75株上面发酵爱尔啤酒酵母来进行酚酸脱羧的转化试验，结果发现，上面发酵酵母菌株的PADl阳性表现率较高；进一步在兼性厌氧筛选过程中，11株上面发酵酵母菌株表现出不同的PADl活性；11株上面发酵酵母菌株的基质特性通过向酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基中补加1 mmol/L的p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸来进行评价，结果发现没有一株酵母菌能够使芥子酸发生脱羧反应，说明一般的上面发酵酵母菌株间PAD1对芥子酸脱羧生成4-VS的作用可能不够明显。HU H F等[27]克隆了地衣芽孢杆菌酚酸脱羧酶（Bacillus licheniformisphenolic acid decarboxylase，BLPAD）基因，然后在大肠杆菌中过表达，最终发现这个酶具有广泛的底物特异性，在100∶74.59∶34.41∶0.29的比活性下，可以使p-香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和芥子酸脱羧。和其他的酚酸脱羧酶相比，BLPAD具有非常好的有机溶剂耐受性和热稳定性，是一种理想的生物催化剂，可用于在两相有机/水反应体系中，将羟基肉桂酸转化为乙烯基酚衍生物，能有效地将p-香豆酸和阿魏酸转化为4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈创木酚。低产率和低产品浓度不利于酚酸脱羧酶生产乙烯基酚衍生物。GU W等[28]报道称来自不同细菌的酚酸脱羧酶很可能是从一个共同的祖先进化而来，并被分离成不同的类群。这些脱羧酶具有高度的序列同源性，在不同的微生物中可能具有共同的催化机制。然而，不同细菌的酚酸脱羧酶在催化性能上存在较大差异。从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、短链芽孢杆菌（Bacillus pumilus）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）等菌株中提取的酚酸脱羧酶，主要对阿魏酸、p-香豆酸和咖啡酸脱羧[29]。与此形成对照的是，植物乳杆菌酚酸脱羧酶（Lactobacillus plantarumphenolic acid de carboxylase，LPPAD）和戊糖片球菌酚酸脱羧酶（Pediococcus pentosaceusphenolic acid decarboxylase，PPPAD）对阿魏酸和咖啡酸的活性大约是对香豆酸的100～1 000倍[30]。这表明BLPAD与芽孢杆菌酚酸脱羧酶（phenolic acid decarboxylase，PAD）具有相似的催化性能。然而，BLPAD比以前报道的PAD具有更广泛的底物特异性。除能使芥子酸脱羧，它具有额外甲氧基基团的酚酸分子，可以使芥子酸的脱羧生成4-VS。该酶具有独特的底物特异性，具有很强的吸引力，是生产4-VS潜在的生物催化剂[31]。

4 总结

啤酒中可以检测到的酚酸大都来自于麦芽（大约70%）和酒花（大约30%）当中，原材料的种类和数量、质量以及不同的酿造工艺都会影响酚酸的含量。芥子酸作为酚酸中羟基肉桂酸的一种，广泛存在于啤酒中。而4-VS作为芥子酸的脱羧产物在啤酒中重要的作用。因此，在两个方面还有必要继续深入研究：①4-VS的结构和成分复杂，对于这种物质在啤酒中的分离、纯化，还没有标准方法。未来应采用高效液相色谱技术进行分离、纯化，并制备高纯度的多酚单体，再采用质谱和核磁共振技术进行结构鉴定，将进一步明确多酚结构、含量和分布。②目前普遍采用化学评价法研究4-VS的抗氧化活性，脱离了有机体独特的生理环境，不能反映多酚真实的抗氧化活性及其作用机理。将来应该着重研究4-VS的抗氧化活性对于啤酒质量的影响，以及啤酒中4-VS的抑菌作用和对人体健康的影响。