雪茄烟叶晾制过程中颜色与水分含量和膜脂过氧化的关系

2020-01-18范宁波张瑞娜路晓崇宋朝鹏邹宇航钟秋邹聪明

中国烟草科学 2020年6期

范宁波张瑞娜路晓崇宋朝鹏邹宇航钟秋邹聪明

摘要：为明确雪茄在晾制过程中烟叶颜色変化机理，以德雪7号上部叶为试验材料，研究了雪茄烟叶晾制过程中变色期的颜色参数（Z、a、b、C、Hパ、Hの、水分指标（含水量、水活度）、膜脂过氧化（O2、H2O2、MDA）程度及抗氧化酶（SOD、POD、APX）活性的变化规律。结果表明，烟叶在色过程中，叶片正面与背面的颜色参数变化趋势一致;随着晾制的进行，烟叶中的水分逐渐散失，且主脉中的水分散失速率低于叶片中的水分散失速率烟叶中活性氧物质（O2、HO2）和MDA含量逐渐增加抗氧化酶活性均有较大的变化，酶活性的変化规律略有不同：SOD和POD活性先增加后降低，APX的活性却一直降低。相关分析表明，水分指标、膜脂氧化程度、抗氧化酶活性與颜色参数之间相关性均较好。

关键词：雪茄;颜色;水分;膜脂氧化

雪茄是一种特殊的烟制品，其香气浓郁，吃味浓，劲头大，是国内目前高度重视发展的烟草类型。不同于烤烟在调制过程中需要避免挂灰、杂色等棕色化反应的特点刚，在雪茄烟叶调制过程中，棕色化反应是改变烟叶内在品质和外观颜色的关键步骤4。雪茄在变色的过程中，会产生吡喃、叱嗪、叱咯、吡啶类等杂环化合物，对烟草的香吃味和风格形成起着重要的作用。因此，研究雪茄烟叶在调制过程中的颜色变化对雪茄的优质生产具有重要的意义。研究发现，烟叶颜色的变化与含水量和细胞膜脂的氧化程度密切相关，烟叶在调制过程中，由于发生水分的散失等生理活动，细胞结构被逐漸破坏，细胞膜逐漸皱缩、破裂，细胞膜脂被逐漸氧化。膜脂在被氧化的过程中，会逐渐产生活性氧物质，O2和H2O2的含量会逐渐增加;

丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是膜脂氧化的最终产物，其含量常被用来衡量细胞膜的破裂程度2。当细胞破裂时，内容物渗出，相互之间发生反应，

造成烟叶的褐变。植物为了消除活性氧物质和DA的毒害作用，进化出了一系列对抗机制：超氧化物化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）、抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）等是生物细胞中消除膜脂氧化影响的最重要的抗氧化酶14。当发生褐变反应时，为了消除有毒物质的影响，细胞中的活性氧清除酶系统纷纷启动。目前关于烟叶在调制过程中的颜色变化，多集中于烤烟中，而对雪茄的关注尚有欠缺。因此本文对雪茄在调制过程中最重要的时期一変色期进行了重点关注，研究了烟叶参数、水分、膜脂氧化程度和抗氧化酶活性的变化，以及雪茄颜色変化与烟叶水分含量和细胞膜脂氧化之间的关系，以期发现颜色变化的内在原因，为雪茄烟叶的变色理论奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

试验于2018-2019年在四川省什邡市师古镇大泉坑村雪茄烟叶生产基地进行，供试品种为德雪7号。试验田土壤有机质含量13.01gkg，速效钾含量89mgkg，速效磷含量38.1mgkg，速效氮含量120mg/kg，按照当地常规优质雪茄烟叶生产技术规范进行统一管理。选取大小、成熟度（适熟）致的上部叶（15～17叶位）采收并进行晾制。

1.2试验设计

将采收的烟叶置于恒温恒湿箱（HWS型，北京中兴伟业仪器有限公司）中进行晾制，参照四川雪茄调制技术参数进行温湿度参数设置（第0～2天为萎蔫期，此时不进行人工干预;第3～7天为色期：温度26℃，湿度控制在95%左右，直至烟叶变褐完成）。在晾制的第0（鲜烟叶）、1、4、5、6、7天，固定选取代表性叶片3片测定颜色参数。同时另取叶片测定水分指标，并取烟叶中间位置的叶片（注意避开脉），迅速转移至-70℃超低温冰箱中保存，用于生理指标的测定。所有指标均进行3次生物学重复。

1.3测定项目与方法

1.3.1烟叶颜色参数使用HP-C210精密色差仪

（深圳汉谱光彩科技有限公司），分别测量叶片正面和背面的颜色参数亮度值、红绿值'和黄蓝值b，并计算饱和度C、色相角、色泽比H。参照文献11비的测定方法，每片烟叶测量6个位点并取其平均值。计算公式为：色泽比（Hの=ab";色相角（の）=arctan（b'a），饱和度（C）=a2+b2。

1.3.2烟叶中水分指标的测定每次取3片烟叶，将烟叶主脉与叶片分离，采用烘箱法分别测定主脉和叶片的含水量，计算整叶含水量取3片烟叶，利用10mm打孔器分别在每片烟叶的叶尖、叶中和叶基部快速打孔40片，平均放入4个样品皿中，利用HD-6型水分活度测量仪（无锡市华科仪器仪表有限公司）进行叶片水活度的测定;将烟叶的主脉按长度平均分成4段，置于样品皿中测定主脉的水活度。

1.3.3活性氧物质（O2、H2O2）和丙二醛（MDA）

含量测定超氧阴离子自由基（O2）产生速率和H2O2含量的测定分别按照试剂盒说明书（苏州科铭生物技术有限公司）测定。以每分钟每克新鲜组织催化羟胺生成NaNO2的物质的量表示O2产生速率，结果以mmol（gmin）表示;H2O2的含量以每克新鲜组织含有的H2O2物质的量表示，结果以umol/g表示;并采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量，结果以molg表示。

1.3.4抗氧化活性测定超氧化物岐化酶（SOD过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX活性均按照SOD、POD、APX酶试剂盒说明书（苏州科铭生物技术有限公司）测定。

1.4数据处理

所有试验取样重复3次，通过SPSS2.0软件对数据进行方差分析，Duncan法进行显著性检验并使用Excel2010进行图表的绘制。

2结果

2.1雪茄在晾制过程中水分含量的变化

烟叶的调制过程是水分散失的过程2，在烟叶的变色过程中，叶片和主脉水分含量呈逐漸降低趋势（图1）。但主脉中的水分含量一直高于叶片中的，失水速率也低于叶片的。至烟叶变色完成时，叶片的水分为25.61%，而主脉中的水分为65.74%。

水活度与含水量密切相关，可用于样品含水量的无损快速测定。进一步用水活度计测定烟叶的水活度值，结果发现，烟叶的水活度变化规律和含水量变化一致，依然呈逐漸降低的趋势且主脉的水活度一直远高于叶片的水活度。

2.2雪茄在晾制过程中叶片颜色的变化

由图2可见，雪茄烟叶在晾制过程中，伴随着烟叶含水量的逐渐减少，叶片逐渐皱缩，其颜色由绿色变黄再褐。烟叶在还没有完全变黄时，叶尖已经略有变褐，且烟叶在褐的过程中，是从叶尖向上，自叶缘向内化。进一步将颜色参数进行量化，发现颜色参数的变化与图片的変化趋势一致（图3）。

由图3可见，晾制过程中烟叶正面与背面的颜色参数化趋势基本一致。亮度值和黄蓝值b从晾制的第1天时即快速增大，并在晾制的第3天时达到了最大值，之后又迅速下降，直至低于初始值（0d）。在変色的过程中，叶片背面的"值一直大于正面的值，而背面的め值一直小于正面的b值。与"值和值先増大后小的変化规律不同，a值在烟叶调制过程中一直保持着增加的趋势，在晾制的前期，'值的增加速率缓慢，几乎无変化，且正面的a"值和背面的"值之间的差别也不大;随着调制时间的增加，'值从晾制的第3天开始迅速增加，晾制5d之后，增加速率又逐漸降低。总体上，a"值的增加速率呈慢快-慢的趋势。

烟叶在变色过程中正面与背面的饱和度C值化规律也一致晾制前期保持一直增加的趋势，并在晾制的第3天达到最大值，之后又迅速下降，在变色完成后，其C值远小于晾制初期时烟叶的C值色泽比随晾制过程的推进而逐漸增加，增加速率较为稳定，逐渐由负值变为正值。色相角在晾制的前4d为负值并逐漸下降，并在第4天时达到最低值，之后又突然增加并在第5天时变为正值之后又略有降低但依然保持为正值。

2.3雪茄在晾制过程中膜脂氧化程度的变化

由图4可以看出，随着晾制时间的增长，烟叶的O2产生速率呈上升趋势。在晾制的前2d，O2的产生速率增加得较为缓慢，从晾制的第3天开始，O2产生速率迅速增加，并且直到变色完成一直保持着显著加的趋势。変色完成时，与晾制第0天相比，O2产生速率増加了1.57倍。

烟叶的H2O2含量与O2产生速率的变化趋势一致，随着调制时间的延长呈现上升趋势，在晾制的前2d，HO2含量增长相对缓慢，伴随着晾制时间的延长，H2O2的含量一直维持着显著增加的趋势。在晾制的第7天时，H2O2含量达到了17.02umolg，与第0天时的504umol/g相比，含量增加了2.38倍。

MDA是膜脂过氧化的产物，具有较强的毒性2。由图4可见，烟叶中的MDA含量呈逐渐增加的趋势，且增加速率也是逐渐上升的，在晾制的前2d，MDA含量的增加速率相对较为缓慢，在晾制的第3天到第7天时，MDA含量迅速增加，表明烟叶在变褐的过程中细胞膜脂过氧化作用增强，导致MDA大量积累，加剧了褐变的发生。

2.4雪茄在晾制过程中内源抗氧化酶活性的变化

由图5可以看出，在烟叶的调制过程中，SOD和POD活性均呈现先上升后下降的趋势，并都在晾制的第3天达到最大值，之后活性迅速降低，在晾制的第7天达到最低值，与晾制开始时相比，此时这两种抗氧化酶的活性分別降低了47.24%和36.82%。与SOD和POD的変化规律不同，抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性自晾制开始即开始下降，与第0天时的酶活性相比，至晾制的第7天时，APX的活性下降了75.89%，其下降幅度大于SOD和POD。

2.5烟叶晾制过程中颜色参数与烟叶水分、膜脂氧化程度和抗氧化酶活性之间的相关分析

由表1可知，烟叶正面、背面的亮度值与SOD、POD活性均具有极显著正相关关系;烟叶正面、背面的红绿值a与叶片和主脉的水分含量以及APX活性均呈极显著负相关关系，与活性氧物质和MDA含量均呈极显著正相关关系;烟叶正面、背面的黄蓝值与SOD、POD活性具有极显著正相关关系，烟叶背面的b值与叶片的含水量以及APX活性均呈显著正相关关系，与活性氧物质、MDA之间均呈显著负相关关系;烟叶正面、背面的饱和度C与烟叶中的水分含量和抗氧化酶活性之间均呈明显的正相关关系，与活性氧物质和MDA之间均呈明显的负相关关系;烟叶正面、背面的色泽比H与烟叶中的水分含量和APX活性之间均呈极显著负相关关系，与活性氧物质和MDA之间呈极显著正相关关系;烟叶正面、背面的色相角与烟叶中的水分和抗氧化酶活性均呈明显负相关关系，与活性氧物质和MDA含量均呈极显著正相关关系。

3讨论

雪茄在调制过程中发生的一系列生理变化，最直观的是颜色的变化：由绿色变为黄色，最终被氧化为褐色。由绿变黄主要是由于叶绿素的降解而褐变则主要是因为细胞破裂，酚类物质渗出，被氧化成醌类物质，进而发生聚合反应而生成“类黑精”，外观上表现为烟叶表面颜色的加深。色差计可以方便快捷地将颜色量化，在烟叶的调制过程中被广泛使用。本研究结果表明，烟叶在晾制过程中烟叶正面与背面各颜色参数变化趋势基本致，且晾制前期烟叶（亮度值）、a"（红绿值）、b”（黄蓝值）逐渐增加，表明此时烟叶主要由较为暗沉的绿色转变为明亮的黄色。、b"在第3天达到最大值后，又逐漸下降，符合此时烟叶逐漸变褐的规律，这与高娅北等的研究结果一致。水分的存在是烟叶中各种保持活性状态的前提，而水分的散失会造成细胞的损伤。在本文的研究中，随着时间的推移，烟叶中的水分减少，结合数据分析，我们可以认为烟叶的颜色化与水分含量之间关系密切。

当烟叶逐漸脱水时，细胞膜脂的氧化作用增强，细胞区室化作用被打破，导致叶绿体等细胞器被破坏2，这可能是水分影响烟叶颜色变化的内在原因。研究发现，褐变与细胞膜脂的氧化密切相关，而SOD、POD、APX是生物细胞中消除膜脂氧化影响的最重要的抗氧化酶。活性氧的积累是引起膜脂过氧化作用的主要原因，在本研究中，随着晾制时间的增加，烟叶中活性氧物质（O2、H1O2）和MDA的含量增加，这与黄山等24在烤烟调制过程中的研究结果一致。伴随着活性氧的积累，抗氧化酶活性将会发生変化，以清除多余的活性氧2。本研究表明，SOD和POD活力在変色前期不断增强并逐步达到高峰，可最大程度清除活性氧，减轻细胞的氧化伤害;伴随着调制时间的增加，细胞氧化程度加剧，酶活力降低，不能及时有效地清除活性氧，导致活性氧物质在烟叶细胞中大量积累。APX也是植物中重要的抗氧化酶，在本研究中，其活性自晾制开始时即一直降低，变化规律与SOD和POD略有不同，然而在变色完成之后，这3种抗氧化酶仍然保持着较高的活性，这可能与雪茄的调制环境较温和，适合酶的存活有关。另外，本文的数据分析表明，抗氧化酶活性和活性氧物质的含量与烟叶的颜色形成之间具有较为紧密的联系。

4结论

在雪茄烟叶的晾制过程中，烟叶的水分含量降低，细胞膜脂氧化程度加剧，抗氧化酶系统启动以清除细胞中的有毒物质。相关分析表明，在雪茄烟叶的晾制过程中，其颜色参数与水分变化和膜脂氧化程度之间相关性明显，这表明烟叶颜色的变化与水分散失和膜脂氧化密切相关。

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