内生解淀粉芽孢杄菌Xe01的鉴定及其发酵条件优化

2020-01-18周向平舒翠华滕凯甘在德肖启明陈武李小慧刘天波

中国烟草科学 2020年6期

关键词：鉴定

周向平舒翠华滕凯甘在德肖启明陈武李小慧刘天波

摘要：为获得对烟草青枯病菌具有拮抗作用的生防菌，从湖南永州青枯病发病较重烟田的健康烟株根系中分离获得1株对烟草青枯病菌具有较强抑菌活性的菌株，对峙培养其抑菌圈直径达到30.5mm，将其命名为Xe01。利用形态观察、生理生化特征及16STRNA基因序列分析鉴定其为解淀粉芽孢（Bacillus amyloliquefaciens），温室盆栽和小区试验中Xe对烟草青枯病的防治效果分别达到56.32%和61.46%。对其发酵培养基及发酵条件进行单因素试验及正交设计优化，最适培养基碳源、氮源和无机盐种类及浓度为葡萄糖90gL、牛肉膏3.0gL、氯化钙4.0gL最佳发酵条件为pH7.0，30℃，180rmin培养52h，使用优化后的发酵条件培养，抑菌圈直径由优化前的30.5mm提高至42.5mm，提高了39.34%。研究结果为解淀粉芽孢杆菌Xe01生防菌剂的开发及应用提供了理论基础。

关键词：烟草青枯病菌;解淀粉芽孢杄菌;鉴定;发酵条件优化

由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病是烟草主要病害之一，给烟草造成严重损失。目前烟草青枯病防治主要依赖化学农药，但生产上尚无有效的化学药剂，且随着人们的生态意识和环保理念的加强，过量施用化学农药带来的3R（残留、抗性和再增猖獗）问题日益受到人们重视。生物防治是一种环境友好和具有良好发展潜力的防治手段，有益微生物利用已成为防控烟草青枯病的研究热点。植物内生细菌与植物高度亲和，内生菌作为生物防治菌株不仅能避免因使用化学农药给人类健康和环境带来的风险，还可减少对植物根际土壤微生态平衡的破坏，在防治植物病害上具有很大应用前景。目前，已从水稻、番茄等植株内分离筛选到具有良好拮抗作用的内生细菌。国内外针对烟草青枯病也筛选了一些内生细菌，如舒翠华等、易有金等从烟草根内筛选到对烟草青枯菌有较好抑制效果的内生拮抗细菌假单胞杄菌、短短芽胞杄菌和枯草芽孢杆菌。此外，为更好地将生防菌应用到生产，发酵培养基和培养条件的筛选和优化必不可少。梁艳琼、刘京兰等1叫通过单因素和正交试验方法分别对解淀粉芽孢杄菌JNC2和CC09液体发酵的最适发酵培养基成分

及发酵条件进行筛选优化，优化后发酵滤液中抑菌活性物质的产量显著提高。由于烟叶种植制度和土壤生态环境的差异，生防菌在大田应用效果不够稳定，菌种本身所具有的优良遗传性状也可能发生变异退化，因此，有必要不断挖掘和发现新的生防菌，并优化其发酵条件，为生防菌应用提供基础。本研究从烟草根内筛选分离得到一株对烟草青枯菌有显著抑制作用的拮抗菌株，通过形态观察、生理生化检测及16STRNA基因序列分析初步鉴定其种属，盆栽和小区试验考察防治效果。采用单因素试验及正交设计优化菌株发酵培养基及发酵条件，以期为后续生产应用提供理论支撑。

1材料与方法

1.1试验材料

内生拮抗菌寄生植物样品于2014年取自湖南省永州市江永县和江华县青枯病发病较重烟田的健康烟株，烟草品种为云烟87。

供试病原菌烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、烟草黑胫病菌（Phytophthora para.silica）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）和西瓜灰霉病菌（Cladosporium cucumerinum）均由湖南农业大学植物病虫害生物学与防控实验室提供。

拮抗细菌的分离、培养用NA培养基，烟草青枯菌培养用LB培养基，烟草黑胫病菌的培养用燕麦培养基，其他病原真菌的培養用PDA培养基。拮抗细菌总DNA提取、16SIRNA片段扩增所用试剂均购自天根生化科技有限公司。

1.2根内细菌的分离

剪取1g清洗干净的烟草根系样品，依次用75%乙醇浸泡1min，无菌水沖洗3次，5%NaCIO泡6min，无菌水冲洗5次后，在无菌研钵中加入10mI无菌水研磨，取1mL研磨液涡旋振荡10min。采用稀释平板涂布法，制备102、103、10-4、10-5、10CFU/ML梯度稀释液，各取0.1mL涂布在固体NA平板上，28℃培养48h。挑取培养特征明显不同的单菌落，于NA平板进行划线纯化，将纯化好的菌株4℃保存备用。

1.3拮抗菌株的筛选

1.3.1拮抗菌株的初筛参照夏艳等方法，制备烟草青枯病菌浓度为1×10°CFU/ml的菌悬液，取1mL加入45℃左右的IB培养基，摇匀，待培养基凝固后，用灭菌牙签挑取1.2中备用菌株单菌落点接于培养基上，每板测试4个菌株，每菌株重复3次，30℃条件下培养48h，十字交叉法测量抑菌圈直径，求平均值。

1.3.2拮抗菌株的复测选取有拮抗活性的菌株接种于NA培养基中，28℃、180r/min培养48h。取发酵液10mL，10000rmin离心10min，用0.22m的微孔滤膜过滤其上清液，得无菌发酵滤液。按1.3.1的方法制备青枯菌平板，在平板四周用直径8mm的打孔器打孔，孔内注入0.1mL无菌发酵液，30℃条件下培养48h，十字交叉法测量抑菌圈直径，求平均值。

1.4拮抗菌株的鉴定

1.4.1形态观察将筛选到有明显拮抗作用的菌株从冰箱取出，NA平板划线，28℃培养48h后挑取单菌落，在新的NA平板上划线28℃培养60h，观察并记录菌落的颜色、形态等特征，并通过光学显微镜和革兰氏染色观察细胞形态。

1.4.2生理生化特征鉴定参照文献[17]进行生理生化试验，每个处理重复3次。

1.4.316S TRNA鉴定拮抗细菌16SIRNAPCR扩参考周鑫钰等的方法。将16S TRNA的PCR扩增产物回收纯化后送上海生物工程有限公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析，并选择同源性比较高的序列用Neighbor-Joining法构建系统发育树材。

1.5拮抗菌株的抑菌谱测定

以7种病原菌为靶标，于9CmPDA或燕麦培养基平板中心接种直径5mm的靶标菌菌饼，用接种环挑取拮抗菌株划线接种在距平板中央3cm处，同时以单独接种病原菌作为对照，每个处理3次重复。28℃恒温培养4d，测量对照和处理的靶标菌菌落直径，计算抑菌带宽度，计算公式为：抑菌带宽度=（对照菌落直径-处理菌落直径）2。

1.6拮抗菌株对烟草青病的防治效果

通过温室盆栽和田间试验考察拮抗菌株对烟草青病的防治效果。设3个处理，处理1：拮抗菌株Xe01;处理2：3%中生菌素WP（福建凯立生物制品有限公司生产）：处理3：清水（对照）。每处理重复3次。盆栽试验每重复20盆，每盆栽烟1株，田间试验每小区面积67m2（植烟100株），随机排列。

盆栽试验在湖南省永州市烟叶生产技术中心试验基地温室进行。取5～6片真叶烟苗移栽于装有灭菌土的花盆，移栽后按处理分别灌根拮抗Xe发酵液（菌量为1×108CFU/mL）、3%中生菌素WP（500倍液）和清水各20mL/株，24h后灌根接种烟草青枯菌菌悬液（1×10CFU/mL）10mL/株。置于温室28～32℃条件下，常规管理。观察烟株发病情况，始见病株后，每7d调查一次病害发生情况，共调查3次。病情分级标准按国家行业标准GB/T23222-2008，统计发病率、病情指数和防治效果。

田间小区试验在湖南省永州市江永县夏层铺镇东铺村旱土烟田进行。选择烟草青枯病发生较重且连作3年以上的田块，移栽时和移栽后30d分别用拮抗菌Xel发酵液（×105CFUm）3%中生菌素WP（500倍液）和清水灌根，每株200mL。在田间烟草青枯病始发期开始调查，调查统计方法同盆栽试验。

1.7发酵培养基成分优化

1.7.1单因素筛选优化最佳碳源、氮源、无机盐种类筛选：分别以玉米粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉替换NA培养基中的葡萄糖;分别以蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白胨、尿素、硝酸铵、硫酸铵替换NA培养基中的牛肉膏汾别以氯化钙、磷酸氢二钾、氯化锰替NA培养基中的氯化钠。

最佳碳源、氮源、无机盐浓度筛选：分别设定葡萄糖60、7.0、80、9.0、10.0、1.0、和12.0g/L，牛肉膏1.0、2.0、3.0、4.0和5.0gL，氯化钙1.02.0、3.0、4.0和5.0gL。

以上试验每组处理设3组重复，在温度28℃、150r/min培养24h，测定菌体量（DD600），按1.3.2测抑菌圈直径，确定最佳碳源、氮源和无机盐种类和浓度。

1.7.2正交优化根据以上单因子筛选的基础上，选择葡萄糖、牛肉膏、氯化钙为考察因素，按照正交设计表（3）设计3个因素、3个水平的正交试验，确定最适配比。

1.8培养条件的优化

1.8.1培养条件单因素优化采用最适培养基配方，依次进行以下条件的优化，每次都将上一优化结果应用于下一因素的优化の。初始pH：41050、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0;温度：26、28、30、32、34、36、和38℃转速：140、160、180、200、220和240r/min;发酵时间：36、40、4448、52、56和60h。每个处理3次重复，测定菌体量（DD6OO）按1.3.2测抑菌圈直径。

1.8.2正交优化根据单因素的优化结果，选择发酵培养初始pH、温度、转速和发酵时间为考察因素，按照正交设计表（3）设计4个因素、3个水平的正交试验，确定最佳发酵培养条件组合。

2结果

2.拮抗菌株的分离和筛选

采用平板梯度稀释法共分离出96株形态不同的菌株，经平板對峙法初筛和复筛，得到15株对烟草青枯病菌具有拮抗效果的菌株，其中JH24、JY46、JY38、JYO5、JY22、JH23、JY37、JH35等菌株的抑菌效果较好，拮抗菌株发酵滤液抑菌圈直径在20mm以上，菌株JY16的拮抗效果最好，抑菌圈直径达到30.5mm（表1和图1）。在转移5代后，菌株JY16菌效果表现稳定，将其命名为Xeol，并进行深入研究。

2.2拮抗菌株的形态特征

对划线后长出的单菌落进行观察，菌株Xe1在NA培养基上呈灰白色，不透明，表面干燥皱缩，边缘不规则，具有较强的黏附性（图2a）：革兰氏染色呈阳性，周生鞭毛，有芽孢，呈杆状（图2b）。

2.3生理生化特征

生理生化试验测定表明（表2），菌株Xe01好氧，明胶液化试验、淀粉水解试验、酪朊水解试验、接触酶反应硝酸盐还原反应、V-P反应结果为阳性硫化试验结果为阴性。根据形态观察并结合生理生化结果，初步确定菌株Xe01为芽孢杄菌属（Bacillus）

2.416S IRNA鉴定

测序结果与Genbank中已知序列比对，菌株Xe1的16S TRNA序列（Genbank登录号为JX477175）与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16STRNA序列同源性高达100%。系统发育树结果表明（图3），菌株Xe0与解淀粉芽胞菌（JQ916086）处于同一个分支，因此将该菌鉴定为解淀粉芽孢杄菌。

2.5拮抗菌株的抑菌谱

抑菌谱测定结果表明（表3），拮抗菌株Xe1对烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫霉病菌、柑橘炭疽病菌、稻瘟病菌和西瓜灰霉病菌均具有抑制作用，其中对烟草黑胫病菌的抑制作用最强，抑菌带宽度达15.1mm。由此说明，Xe1的抑菌谱广，具有较好的应用前景。

2.6拮抗菌对烟草青枯病的防治效果

温室盆栽和小区试验结果表明（表4），拮抗菌对烟草青枯病有明显防治效果，施用拮抗菌株Xe01显著降低了烟草青枯病的发病率和病情指数，温室盆栽试验拮抗菌Xe对烟草青枯病的防效为56.32%，小区试验防效为61.46%，防效均好于药剂防治。

2.7发酵培养基的优化

2.7.1单因素筛选碳源、氮源、无机盐种类筛选不同碳源、氮源和无机盐对Xe1的菌体量和抑菌活性影响较大，以葡糖为碳源时菌体量达到最大（OD=1.29），抑菌圈也最大（31.5mm）（图4a）以牛肉膏为氮源时菌体量达到最大（ODoo=1.3），抑菌活性也最大（抑菌圈直径31.6mm）（图4b）;以氯化钙为无机盐时菌体量达到最大（OD0=1.43）抑菌圈也最大（3.7mm）（图4c）。因此，葡萄糖、牛肉膏和氯化钙为最适碳源、氮源和无机盐组分。

葡萄糖、牛肉膏和无机盐浓度筛选：不同浓度葡萄糖、牛肉膏和氯化钙对Xel菌体量和抑菌活性有显著影响。随着浓度的增加，Xel菌体量和菌活性先随之増加，达到高峰后，随着浓度加Xe1菌体量和抑菌活性反而下降。在葡萄糖10gL时菌体量（OD600=153）和抑菌活性（抑菌圈直径337mm）最大（图5a），牛肉膏3gL时菌体量（ODo=1.54）和抑菌活性（抑菌圈直径33.8mm）最大（图5b），氯化钙2gL时菌体量（ODo=1.56）和抑菌活性（抑菌圏直径33.9mm）最大（图5c）。因此，葡萄糖10gL、牛肉膏3gL、氯化钙2gL为Xe01菌株发酵最佳浓度。

2.7.2正交优化根据上述单因素试验结果，采用

（3）正交表，设计了3因素3水平的正交试验，进一步确定影响XeOl菌株抑菌活性的最佳组合，结果见表5。由极差R值的大小（Rc》R》R2）可以看出，影响XeO菌株抑菌活性的因子强度由强到弱依次为C（氯化钙）》A（葡萄糖）》B（牛肉膏），氯化钙浓度是影响XeO菌株抑菌活性的最重要因子。结合K值，适合Xe菌株发酵的最优组合为A1BC3，即葡萄糖9.0g兀L、牛肉膏3.0gL，氯化钙4.0gL。在此培养基条件下，菌株Xe发酵滤液对烟草青枯病菌的抑菌直径达到36.1mm，比基础培养基培养的抑菌圈直径（30.5mm）増加了18.4%。

2.8发酵培养条件的优化

2.8.1单因素筛选初始pH（图6）：在pH7时菌体量达到最高（ODo01.61），抑菌活性最高在pH6和pH7，抑菌圈直径分别为37.0和37.6mm，低于或高于该pH值，抑菌活性则显著降低。可见，pH67为Xc菌株发酵最佳pH。

培养温度（图7）：在32℃发酵条件下，Xe1菌体量最高（ODoo=1.60），低于或高于此温度，均不利于Xe菌株的生长，而在32～34℃时抑制活性最高。可见，Xe01菌株发酵最佳温度为32～34℃。转速（图8）：摇床转速在180r/min时Xel菌体量和抑制活性均达到最大（ODo1.66，扣菌直径37.5mm），转速高于或低于180r/min，Xeol菌株的菌体和抑制活性均显著下降。因此，Xe0菌株发酵最佳转速为180rmin。

發酵时间（图9）：在发酵时间48h和56h时菌体量达到最高，在52h和56h时抑菌圈直径达最大，然后逐漸少。因此，XeOl菌株发酵最佳发酵时间为48～56h。

2.8.2正交优化根据上述单因素试验结果，采用o（3）正交表，设计4因素3水平的正交试验，进步确定影响XeO菌株抑菌活性的最佳发酵条件组合，结果见表6。由极差R值可见，4种因素对Xe1菌株抑菌活性影响力的强弱顺序为A（pH）》B（温度）》C（转速）》D（培养时间）。结合K值，最优发酵条件组合为A3B1C2D2，即pH7.0，30℃，180r/min，培养52h。在此培养条件下，验证对烟草青枯病菌的抑制活性，抑菌圈直径达到42.5mm比初始培养条件抑菌圈直径（30.5mm）増加了39.34%。3讨论

传统的生防菌种大多来自土壤，从土壤中筛选出的拮抗细菌通过抑制土传病原菌的繁殖达到防病的效果2-2内生拮抗细菌能进入植物组织，与病原菌竟争空间与营养，可在植物内部抑制病原菌的繁殖，能更好地防治病原菌，较传统的土壤细菌更有优势，已成为防治植物病害的一个重要菌种资源来源2。本研究通过稀释涂布平板对峙法从烟草根内筛选获得一株具有较强抑菌活性的拮抗细菌（Xe01），通过形态观察、生理生化检测及16SrRNA基因序列分析初步鉴定其种属，初步鉴定为解淀粉芽孢菌（Bacillus amyloliquefaciens）。拮抗菌株对烟草青枯病菌具有较好的抗菌活性，还可以制烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌和辣椒炭疽病菌等常见病原菌，抑菌范围比较广泛，应用前景良好。优化生防菌培养液组分可以提高菌体的菌体量和抑菌活性物质产量，进而提高生防效果242本研究将Xel的菌体量及抑菌活性作为主要考量指标，发现培养基碳源、氮源和无机盐种类及浓度为葡萄糖9.0gL、牛肉膏3.0gL、氯化钙4.0gL时，菌体量最大，抑菌活性最佳，但抑菌活性物质含量的变化暂未分析。初始pH、培养温度、转速和发酵时间影响其活菌数量以及对病原菌的抑制效果，它们之间互相作用、互相影响，高产发酵需要各因素之间的最佳组合。因此，解淀粉芽孢杆菌发酵条件的优化除采用单因素外，同时还需考虑多因素及其交互作用。本研究通过单因素和正交试验优化了培养条件，发现pH70，30℃，180rmin，培养52h时抑菌圈直径达42.5mm，比优化前增加了39.34%。本研究只是在摇床条件下对菌株Xe01培养条件进行优化，今后还需进行小试、中试，以验证和完善发酵工艺，获得适合发酵罐的发酵工艺，在实际工业化生产中对发酵条件的控制方法也有待于进一步研究，为下一步抑菌活性物质的分离鉴定以及田间实际应用提供理论参考。

解淀粉芽孢杄菌不仅能够产生多种抗菌物质，抑制植物病原菌生长，而且能促进植物生长和诱导植物产生系统抗性。权春善等2、林巧玲等分离筛选的解淀粉芽孢杄菌Q-12对植尖孢镰刀菌具有较好抑制作用，解淀粉芽孢杆菌SH-27能显著降低大豆疫病的病情指数，促进根系生长。本研究筛选的拮抗菌株解淀粉芽孢杆菌Xe1对烟草青枯病菌具有较好的抑菌活性，温室盆栽和小区试验对烟草青枯病的防治效果达到50%以上，防治效果与姜乾坤等、易有金等筛选的生防菌相当。但拮抗菌株XeO如何发挥作用，是否还具有促进植物生长和诱导植物抗性等作用暂不明确，后续将对XeO1的生防机制及其抑菌物质的分离纯化等方面进行更深入的研究。

4结论

本研究筛选获得一株对烟草青枯菌具有较好抑制作用的解淀粉芽孢杄菌Xe0，盆栽和小区试验表明其对烟草青枯病的防治效果良好。优化了发酵培养基和发酵条件，优化培养后抑菌活性提高了39.34%，为解淀粉芽孢杄菌XeO防治烟草青枯病及生防菌剂的开发应用提供了理论基础。

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