烟草西柏三烯二醇稳定性及其抑菌活性研究

刘雨露 张建会 付秋娟 韩晓 解胜男 肖勇 杜咏梅

摘要：为明确西柏三烯二醇（CBT-diols）的稳定性及其抑菌活性，采用高效液相色谱法定不同光照、温度、pH、溶剂条件下CBT-diols的降解规律，并以烟草黑胫病病原真菌为供试材料，采用菌丝生长速率法研究CBT-dolls降解对抑菌效果的影响。结果表明，光照、温度、pH、溶剂等均对Cbt-diols降解率产生显著影响，且其降解率随暴露时间延长而增加，但抑菌活性降低幅度显著低于降解率升高幅度CBT-dois在阳光暴露63h后降解（36650.86）%，其抑菌率降低了（20.980.16）%日光灯光强410KLUX范围内，不同光强间CBT-diols降解率差异不显著;随温度升高，CBT-dois降解率显著升高，80℃条件下暴露40h后降解了（89032.29）%，菌丝生长抑制率降低了（55.000.72）%;CBT-dolls在pH79范围内有较好的稳定性和抑菌活性;CBT-dolls在乙醇溶剂中最稳定，在二甲基亚砜、正丙醇溶剂中稳定性相对较差;不同暴露条件下，B-CBT-dois稳定性优于q-CBT-dolls。

关键词：烟草;CBT-dolls：稳定性;抑菌活性

西柏三烯二醇（Cembratrien-diols，CBT-dolls）屬西柏烷型二萜（Cembranoid type diterpenes）类化合物，该类化合物主要存在于海洋生物（主要为软珊瑚、柳珊瑚）及烟草、松属、大戟属等植物中，以烟草中含量最为丰富。CBT-dolls是烟草腺毛分泌物的主要成分，目前分离鉴定出的异构体有两个，分别为、-2，7，11-西柏三烯-4，6-二醇（、-CBI-doil）P2，不同类型烟草中两者一般以2：1～3：1的比率存在。CBT-dolls在烟草花序中含量最高，可达3.5%5。研究表明，CBT-dolls不仅是卷烟优雅香气的重要前体物质，还具有抑菌、杀菌、抗肿瘤和神经保护等多种生物活性，在生物农药、医药等方向具有较好开发价值。目前国内外对CBT-dolls的抗菌活性有较多的报道，MENETREZ等发现CBT-doil的两种异构体都可抑制烟草蓝色霉菌孢子的萌发。KENNEDY等2研究发现α、B-CBT-diols对巴氏芽孢杆菌孢子的半数抑制浓度（ICso）分别为3.0和2.9ugm2随后发现CBT-dolls可抑制黄瓜炭疽病孢子萌发。DUAN等采用生长速率法测定烟草提取物对来自子囊菌门、半知菌亚门和担子菌门的11种致病性植物真菌的抑制作用，发现CBT-dolls是烟草提取物中的主要抑菌物质。YANG等发现CBT-dois不同异构体、β-CBT-doil对灰葡萄孢菌菌丝生长的FCs值分别为13.11和12.34mgL，两者抑制率差异不显著，且不存在协同增效作用。CBT-dolls还具有良好的调节植物生长、增强植株抗病性等活性，在植物源杀菌剂方向有较好开发前景究植物源提取物在自然环境下的降解特性及对其抑菌活性的影响，是进行杀菌制剂研发并提高药效的基础。本研究分析了不同光照、温度、pH、溶剂等条件下CBT-dolls不同异构体的降解规律，并以烟草黑胫病原真菌为材料，采用室内菌丝生长速率法，研究了CBT-dolls降解对抑菌效果的影响旨在为CBT-dolls杀菌制剂研发利用和稳定性的改良提供研究基础。

1材料与方法

1.1材料及仪器

1.1.1供试材料烟草CBT-doil浸膏：本实验室制备，质量分数为70%，其中q-CBT-dolls：B-CBT-doil=3：1。

10%CBT-dolls微乳剂制备：准确称取10%CBT-dolls浸膏，加入10%环己酮和20%正丁醇搅拌均匀，加入25%乳化剂3625，搅拌均匀透明后加水补足。

供试菌株：烟草黑胫病菌（Phytophthora parasiticavar.nicotianae），由中国农业科学院烟草研究所植物保护研究中心提供。

1.1.2试剂乙醇、二氯甲烷、环己酮、二甲基亚砜、正丙醇、正丁醇、柠檬酸、柠檬酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产;乙腈为色谱纯，MERCK公司生产。

1.1.3主要仪器与设备WatersACQUITYUPLCH-class超高效液相色谱仪，美国Waters公司生产;ZF-20D暗箱三用紫外分析仪，骥辉分析仪器有限公司生产;CONVIRONADAPTIS-A1000探入式多用途植物培养箱，上海泽泉科技股份有限公司生产电热恒温鼓风干燥箱，杭州蓝天化验仪器厂生产;SartoriusPB-10酸度计，赛多利斯科学仪器有限公司生产AL104电子分析天平（感量0001g），梅特勒-托利多仪器有限公司生产。

1.2试验设计

1.2.1试验样品制备参照张帅等的方法。称取定质量的CBT-dolls浸膏，配制成0.6%的CBT-dolls-二氯甲烷溶液，准确移取5mL配制好的上述溶液于直径为6cm的玻璃培养皿中，将培养皿水平放置于通风橱中，待溶剂自然挥发后，CBT-dolls均匀涂布在培养皿中，备用。

1.2.2CBT-dolls在不同光照、温度条件下的稳定性（1）CBT-doil阳光暴露试验：该试验于2019年9月10-17日（8：3017：30）在中国农业科学院烟草研究所四川省凉山州西昌市西南试验基地进行，试验地点昼温20～24℃，光照强度3.73～68.8kLux。将1.2.1中制备的涂布CBT-dolls的培养皿放置于太阳光下照射（3.7368.8kLux），暴露时间分别为3、6、9、12、15、18、21、24、27、33、39、4554、63h，每处理3个重复，以0h处理为对照。各处理阳光暴露试验完成后，培养皿中CBT-dolls用5mL95%乙醇溶解，用液相色谱法（1.3）测定CBT-dolls的含量，用菌丝生长速率法（1.4）测定不同处理的抑菌活性。

（2）不同光照强度及光源暴露试验：将1.2.1中制备的培养皿放置于4、6、8、10kLux日光灯、

24W紫外灯下照射，暴露时间分别为：0、2、4、6、8、16、24h，每处理3个重复，以0h处理为对照。各处理光照暴露试验完成后，CBT-dolls降解率测定同上。

（3）温度处理试验：将1.2.1中制备的培养皿放置于烘箱40、60、80℃恒温加热，暴露时间分别为：0、4、8、12、16、20、24、32、36、40h，每处理3个重复，以0h处理为对照。各处理温度暴露试验完成后，CBT-dolls降解率及抑菌活性测定同上。

1.2.3CBT-dolls在不同pH条件下的稳定性配制pH为4、5、67、9、11的缓冲液。准确移取2mL09%6CBT-dolls微乳剂放入盛有28mL上述缓冲液的玻璃试管中，混匀，室温避光放置0、1、2、3、4、5、6、7d，每处理3个重复，以0d处理为对照。各处理试验完成后，CBT-dolls降解率及抑菌活性测定同1.2.2。

1.2.4CBT-dolls在不同溶剂条件下的稳定性根据CBT-dolls溶解特性，选取环己酮、二甲基亚砜、乙醇、正丙醇、正丁醇为溶剂，分别配制成0.6%的CBT-dolls溶液，放入石英具塞试管中，置于8KLUX日光灯下照射，暴露时间处理分别为：0、1、2、3、4d，每处理3个重复，以0d处理为对照。各处理试验完成后，CBT-dolls降解率测定同1.2.2。

1.3CBT-dolls检测

参照付秋娟等的方法，利用超高效液相色谱（UPLC）进行检测。以上各处理获得的CBT-dolls溶液，用流动相（60%乙腈）稀释、混匀，以0.22um有机滤膜过滤至液相安瓿瓶中，UPIC检测。

CBT-dolls降解率计算公式：Y=（R-R，）/Rox100%，式中Y表示CBT-doil降解率（%）Ro表示对照处理的CBT-dollsI的质量（mg）;R，表示光照等处理后CBT-dolls的质量（mg）。

1.4不同处理抑菌活性测定

参照DUAN等的方法，采用菌丝生长速率法测定不同条件处理后的药液对供试真菌的抑制作用，将药液与培养基以1：100的体积比混匀制成含药培养基，待凝固后，接入生长状态一致的直径为5mm的菌饼，于28℃培养，待对照平板菌圈生长至平板约2/3处时，用十字交叉法测定菌落直径，然后按（1）、（2）式计算不同处理对烟草黑胫病病原菌菌丝生长的抑制率。

菌圈直径（mm）=实际测得直径-5

菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100

1.5数据分析

试验数据采用SAS9.1和Excel软件进行统计分析，应用Duncan氏新复极差法进行多样本间差异显著性检验（p《0.05）。

2结果

2.1光照对CBT-dolls降解及抑菌活性的影响

2.1.1阳光暴露条件下CBT-oils降解率的变化及

抑菌活性阳光暴露对CBT-dolls的降解率及抑菌活性的影响见图1。由图1看出，随暴露时间延长，CBT-diols降解率呈持续增加趋势，而其抑菌活性则呈持续降低趋势。CBT-dolls在太阳光中暴露63h，降解率达（360840.07%，菌丝生长抑制率由（68340.34）%降低至（54.740，29）%，降幅為（20.980.16）%，其抑菌活性降低的幅度显著低于降解率升高的幅度。CBT-dolls在阳光暴露627h范围内，其降解率及对菌丝生长的抑制率变幅均较小;暴露33h后，CBT-doil降解率迅速升高，但对菌丝生长的抑制率降幅较小，且在暴露时间33～63h内，CBT-dolls对菌丝生长的抑制活性差异不显著。

2.1.2不同光照强度及光源对CBT-dolls降解的影响不同光照强度及光源对CBT-dolls降解率的影响见图2。由图2看出，随光照时间延长，不同光照强度的日光灯及紫外灯光源条件下，CBT-doilse的降解率均呈持续增加趋势。本试验条件下，CBT-dolls在日光灯4、6、8、10kLux光强和紫外光条件下暴露24h后降解率分别为（21.3540.70%（21.750.70）%、（21.260.96）%、（21.20生1.09）%（31.600.69）%。同一光照时间条件下，日光灯不同光照强度处理间CBT-dolls降解率差异不显著。暴露时间16～24h范围内，紫外照射条件下CBT-coils降解率显著高于4～10kLux日光灯照射。

2.2温度对CBT-dolls降解及抑菌活性的影响不同温度对CBT-doil的降解率及80℃处理对CBT-dolls抑菌活性的影响见图3。由图3看出，温度处理48h内，CBT-dolls降解速窣较慢，且不同温度处理间降解速率差异不显著，至12h以后，随暴露时间延长，不同温度处理CBT-dolls降解速率均呈显著增加趋势，且不同温度处理间CBT-dolls降解速率差异显著，表现为80℃》60℃》40℃;暴露40h时，CBT-dolls在40、60、80℃条件下的降解率分别为（13.53+0.91）%、（29.390.15）%、（89032.29）%80℃暴露40h后，CBT-dolls对菌丝生长抑制率降低了（55000.72）%，说明80℃条件下暴露12h后，CBT-dolls迅速降解，但其对菌丝生长抑制率降低速率低于其降解速率。

2.3溶液pH对CBT-dolls降解及抑菌活性的影响不同pH条件下CBT-dolls降解率及其抑菌活性的变化结果见表1、2。由表1看出，不同pH条件下，随暴露时间延长，CBT-dolls降解率均呈显著增加的趋势。在pH45条件下，CBT-dolls降解幅度较大，稳定性较差，而在pH6～11尤其是pH7-9条件下，降解幅度相对较小，稳定性相对较好。由表2看出，pH4～11范围内，CBT-dolls1均保持较高的抑菌活性。

2.4溶剂对CBT-dolls降解的影响

CBT-doil在不同溶剂中降解率的变化结果见表3。由表3看出，随暴露时间延长，CBT-dolls在不同溶剂中降解率均呈显著增加趋势，但在同一暴露时间条件下，CBT-dolls在不同溶剂中的降解率也存在显著差异。CBT-dolls在乙醇、正丁醇、环己酮溶剂中降解率较低，稳定性较好，尤其在乙醇中稳定性最佳。因此在进行CBT-dolls杀菌剂的研制时，可首选乙醇作为溶剂。

2.5不同暴露条件对CBT-doil不同异构体降解率的影响

为进一步考察不同暴露条件对CBT-dolls不同异构体降解率的影响，将不同光照、温度、pH、溶剂条件下暴露前后-CBT-dolls与-CBT-dolls的质量比（ma/mg）列于表4.由表4看出，CBT-dolls在太阳光、紫外灯和日光灯4kLu暴露前后mmp值无显著差异，而在日光灯6～10klux暴露后，mmp值显著降低。

CBT-doil在40℃暴露40h，mm值无显著差异，随着温度的升高，60-80℃暴露40h后mmp值均显著降低，且温度越高降幅越大。

不同pH值缓冲溶液中momp值差异较大，可能是由于缓冲溶液体系中的复杂离子对CBT-dolls结构产生了影响。pH值46条件下暴露7d后，mmp值显著降低，且pH值越低降幅越大。pH7-9条件下暴露7d后，mom值差异不显著。综合CBT-dolls及其不同异构体在不同pH条件下降解率的差异，CBT-doil在pH7-9条件下较为稳定。在环己酮溶液中暴露4d后，m/mp值显著降低，而在二甲基亚砜、乙醇、正丙醇、正丁醇溶液中，mom值则变化不显著。

综上分析，不同条件下暴露后，mmp值或者差异不显著，或者显著降低，无m∥m值显著升高的现象。在CBT-dolls降解率较低的情况下，α与β-CBT-dolls降解率差异不大，但在CBT-dolls降解率较高的情况下，β-CBT-dolls降解率低于a-CBT-dolls，说明β-CBT-doil稳定性较-CBT-doli。

3讨论

光化学降解是农药在环境中分解的主要途径之ー，也是影响农药药效及环境残留的重要因素。

吴传万等1发现，在太阳光或20W紫外灯照射下，苦参碱光半衰期均小于1h，阿维菌素光半衰期均在3h左右。张帅等研究发现表鱼藤酮365m紫外光照射后半衰期为2.3h。本研究表明，CBT-diols在太阳光（3.7～68.8kLux）、日光灯（4～10kLux）、紫外灯暴露条件下，均会发生降解，其24h降解率分别为13.27%、21.20%～21.75%、31.60%，CBT-diols阳光暴露63h降解率为36.08%。因此，与其他生物农药相比，CBT-dolls具有较好的光稳定性。

CBT-diols在不同光源条件下暴露16h后，紫外光暴露下的降解率显著大于阳光、日光灯，这可能由于Cbt-diols结构中双键的a位（烯丙位）易吸收紫外光发生自由基反应，从而使目标化合物产生降解。在日光灯4～-10kLux范围内，不同光照强度对CBT-diols降解率影响不大，这可能与CBT-diols对日光光波没有吸收有关。

热贮稳定性是农药制剂质量评价的重要指标。本研究表明，温度对CBT-diols降解率影响较大，随温度升高，CBT-diols降解率呈显著升高趋势。CBT-diols在高温下降解原因也可能与双键的位（烯丙位）在高温下易发生自由基反应有关。在CBT-diols农药制剂研制中，需加入抗氧化剂以提高其热贮稳定性。

CBT-diols1在pH45范围内降解率较高，在pH6～11范围内降解率显著降低，可能是由于在酸性条件下，醇羟基容易与以氢键结合形成氧盐，氧盐脱水生成碳正离子，碳正离子遵循扎依切夫原则，发生消去反应形成更稳定的结构，下ー步还需通过试验验证上述现象。根据CBT-diols在不同pH范围的降解特性，CBT-diols应避免与酸性农药混用。本硏究表明，CBT-diols在阳光、高温条件下抑菌活性降低幅度均显著低于降解率升高幅度;CBT-diols在pH45范围内，降解率显著较高，但其抑菌活性却与pH6～11范围无显著差异，这可能与CBT-diols的降解物仍具有较高的抑菌活性有关。刘亚南等研究发现，玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性代谢产物roflamycoin对太阳光和日光灯光源敏感，而紫外光并不能引起其光分解。Roflamycoin光照分解后对12种病原菌仍有抑

制作用，其中对番茄灰霉病菌、玉米穗腐病菌等6种病原菌的抑制活性显著增强，推测roflamycoin的光分解产物仍具有抑菌活性。以上研究结果与本研究相似。

本研究表明，β-CBT-dois稳定性相对优于-CBT-dolls。因此，在以CBT-dolls提取物作为杀菌剂的实际应用中，为提高烟草CBT-dolls提取物的稳定性，可以筛选β-CBT-dolls含量较高的烟草材料，或通过生物技术手段提高β-Cb-doils含量。

4结论

本研究发现，光照、温度、pH、溶剂均对CBT-dolls降解率产生显著影响，降解率随暴露时间延长而升高，抑菌活性随暴露时延长而降低，但菌活性降低幅度显著低于降解率升高幅度。CBT-diols在紫外光下较在其他光下更易降解，不同日光照射强度對CBT-diols降解率的影响差异不显著。80℃条件下CBT-diols易降解，CBT-diols在pH79范围内具有较好的稳定性和抑菌活性，CBT-diols在乙醇溶液中最为稳定。不同暴露条件下，β-CBT-dolls稳定性较-Cb-doils高。下一步将对CBT-diols在不同暴露条件下的降解产物进行深入研究，以揭示CBT-diols降解机制。

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