miR-424负调控PAK2基因抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导凋亡的体外研究

李若飞，解俊杰，梁慧萍，吴静

咸阳市中心医院骨四科1、皮肤美容科2，陕西 咸阳 712000

骨肉瘤是原发于骨髓内的高恶性肿瘤，是最常见的原发性恶性骨肿瘤，75%的患者在10～30岁发病，且好发于男性[1]。骨肉瘤易复发并且早期转移率非常高，在初诊的骨肉瘤患者中有10%～20%出现远处转移，且90%为肺转移，骨肉瘤一旦发生转移和复发就预示预后不良[2]。因此阐明骨肉瘤的发生发展机制，对改善骨肉瘤的诊断方法和提高治疗效果有重要意义。

大量研究表明，微小型RNA(microRNA，miRNA)是一类17～25 nt长短的小RNA分子，不具有蛋白编码功能。miRNA在调控细胞增殖、凋亡、肿瘤血管生成、浸润及转移中发挥着重要作用[3]，通过与靶基因mRNA上特定序列结合，可以剪切靶基因的mRNA分子或抑制靶基因蛋白质翻译，从而起到调控靶基因的作用[4]。研究发现，骨肉瘤细胞中miR-424抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡[5-6]，但其具体分子机制尚不清楚。研究发现，PAK2在乳腺癌细胞中上调，抑制其表达抑制细胞增殖和转移[7]。头颈鳞癌中PAK2-c-Myc-PKM2轴是一个致癌通路，促进癌症进展[8]。PAK2基因在骨肉瘤中的表达尚无报道，本文就miR-424和PAK2对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响以及miR-424是否可通过调控PAK2基因来抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导其细胞凋亡展开研究，以期为今后骨肉瘤的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 健康人成骨细胞系hFOB1.19、骨肉瘤细胞系MG63、U2-OS、SOSP-9607购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和DMEM培养液购于Gibco，RT-PCR相关试剂盒购于日本TaKaRa,miR-424、内参U6的引物购于美国ABI公司，LipofectamineTM2000转染试剂盒购于美国Invitrogen公司，一抗PAK2购自美国Abcam公司，总蛋白提取试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司，CCK-8试剂盒购于Dojindo。细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞常规培养于含10%FBS的DMEM培养液中，其中青霉素1×105U/mL，链霉素100 mg/mL。置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，选择对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 Real-time PCR法检测RNA的表达 根据Trizol法抽提总RNA，按照PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒说明书进行操作，合成cDNA。miR-424-F：5'-CAGCAGCAATTCATGTTTTGAA-3'，miR-424-R：5'-CAAAACATGAATTGCTGCTGT-3'；PAK2-F：5'-TG AGCACACCATCCATGTTGG-3'，PAK2-R：5'-AGGT CTGTAGTAATCGAGCCC-3'；U6 作为内参，U6-F：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'； U6-R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。按照SYBR Green I PCR检测试剂盒说明书在ABI7500荧光定量PCR仪中进行PCR扩增反应，反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性 5 s，60℃退火 32 s，70℃延伸30 s，循环40次。溶解曲线分析：95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃15 s。2-△△Ct法测定各基因mRNA的相对表达水平。每个样品孔重复检测3次，取均值。

1.2.3 Western bolt检测蛋白的表达 按照蛋白提取试剂盒说明书提取各实验组细胞的总蛋白。根据BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度，取25 g蛋白上样，SDS-PAGE充分分离后，转到聚偏氟乙烯膜，室温条件下封闭液封闭1 h，加稀释后I抗，4℃条件下过夜，第二天用TBST洗膜3次，每次15 min，之后加入相应Ⅱ抗，室温条件下孵育2 h，TBST洗膜，加入显影液显影，以β-actin作内参，利用Image J软件计算条带灰度比，利用统计软件进行统计分析。

1.2.4 细胞转染 收集对数生长期的骨肉瘤U2-OS细胞，适当密度接种到6孔板上。细胞融合到70%时，根据LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书将过表达miR-424的模拟物和其miR阴性对照转染至U2-OS细胞中，分别标记为miR-424组和miR-con组。转染5 h后换为含血清的新鲜培养基继续培养，并用RT-PCR检测转染效果(参照上述1.2.2中的方法)。后续试验中，将U2-OS细胞随机分为anti-miR-424组(转染干扰miR-424的模拟物)、anti-miR-con组(转染干扰miR-424的miR阴性对照)、si-PAK2 组(转染沉默PAK2的siRNA)、si-con组(转染沉默PAK2的阴性对照)、miR-424+pcDNA-PAK2组(miR-424模拟物与pcDNA-PAK2载体共转染)、miR-424+pcDNA组(miR-424模拟物与pcDNA空载体共转染)六组，采用上述方法转染后进行后续实验。

1.2.5 CCK-8法检测细胞活力 将对数生长期的各组U2-OS细胞消化后，以每孔5×103的密度接种于96孔板中，放于细胞培养箱中培养24 h，后加入10 L CCK-8溶液，培养箱中培养2 h，酶标仪在490 nm波长处检测各孔吸光度值。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组待测细胞，离心漂洗去上清后，按照Annexin V-FITC凋亡试剂盒说明书进行操作。具体用缓冲液重悬细胞，轻摇至均匀，避光孵育15 min，加入适量Annexin V-FITC，避光条件下孵育15 min。采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3 统计学方法 应用SPSS22.0软件进行数据统计分析，计量数据均经正态性检验符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较使用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤细胞系和健康人成骨细胞中miR-424和PAK2的表达水平比较 与健康人成骨细胞hFOB1.19相比，骨肉瘤细胞系 MG63、U2-OS、SOSP-9607中miR-424的表达量明显下降，PAK2的mRNA和蛋白的表达量明显上升，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图1和表1。

图1 骨肉瘤细胞系和健康人成骨细胞中PAK2蛋白表达

2.2 上调miR-424表达对骨肉瘤细胞U2-OS增殖和细胞凋亡的影响 与miR-con组比较，上调miR-424表达明显增加骨肉瘤U2-OS细胞中miR-424的表达量、细胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax的表达量，显著降低48 h和72 h的细胞活力、促增殖蛋白Cyclin D1的表达量、抑凋亡蛋白Bcl-1的表达量，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而24 h的细胞活力差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2和图2。

表1 骨肉瘤细胞系和健康人成骨细胞中miR-424和PAK2的表达水平比较(±s，n=6)

表1 骨肉瘤细胞系和健康人成骨细胞中miR-424和PAK2的表达水平比较(±s，n=6)

注：与hFOB1.19组比较，aP＜0.05。

组别hFOB1.19组MG63组U2-OS组SOSP-9607组F值P值PAK2蛋白0.46±0.03 0.76±0.06a 0.85±0.06a 0.82±0.08a 53.007＜0.05 miR-424 1.00±0.07 0.48±0.05a 0.25±0.02a 0.33±0.03a 313.471＜0.05 PAK2 mRNA 1.00±0.08 4.45±0.45a 5.87±0.59a 4.28±0.43a 137.353＜0.05

表2 上调miR-424表达对骨肉瘤细胞U2-OS增殖和细胞凋亡的影响(±s，n=6)

表2 上调miR-424表达对骨肉瘤细胞U2-OS增殖和细胞凋亡的影响(±s，n=6)

组别miR-424细胞活力(OD490 nm)细胞凋亡率(%)Cyclin D1Bcl-2Bax miR-con组miR-424组t值P值0.99±0.08 4.58±0.41 21.051＜0.05 24 h 0.38±0.02 0.36±0.02 1.732 0.114 48 h 0.79±0.04 0.54±0.03 12.247＜0.05 72 h 1.19±0.06 0.81±0.05 11.918＜0.05 8.47±0.55 21.75±1.38 21.897＜0.05 0.87±0.05 0.45±0.03 17.644＜0.05 0.58±0.05 0.43±0.04 5.738＜0.05 0.47±0.05 0.78±0.06 9.722＜0.05

图2 骨肉瘤细胞U2-OS凋亡率及增殖和凋亡相关蛋白表达注：A，流式细胞术检测骨肉瘤细胞U2-OS凋亡；B，Western blot检测骨肉瘤细胞U2-OS中Cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白表达。

2.3 miR-424靶向PAK2并负向调控其表达 TargetScan(http://www.targetscan.org/)软件检测结果，miR-424和PAK2之间存在互补结合位点，见图3A。双荧光素酶报告基因试验结果表明，同miR-con与WT-PAK2共转染相比，miR-424与WT-PAK2共转染后，U2-OS细胞荧光素酶活性明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；而miR-con、miR-424分别与MUT-PAK2共转染后，U2-OS细胞荧光素酶活性变化不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。与miR-con组相比，miR-424组中PAK2蛋白的表达量显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；相反，anti-miR-424组中PAK2蛋白的表达量较anti-miR-con组显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4和图3B。

图3 miR-424与PAK2互补的核苷酸序列以及miR-424调控PAK2表达

表3 双荧光素酶报告实验(±s，n=6)

组别miR-con组miR-424组t值P值WT-PAK2 1.00±0.05 0.63±0.07 10.536＜0.05 MUT-PAK2 0.96±0.09 1.08±0.12 1.960 0.079

表4 miR-424调控PAK2的表达(±s，n=6)

注：与miR-con组比较，aP＜0.05；与anti-miR-con组比较，bP＜0.05。

组别miR-con组miR-424组anti-miR-con组anti-miR-424组F值P值PAK2 0.81±0.04 0.38±0.05a 0.69±0.06 0.92±0.08b 92.482＜0.05

2.4 下调PAK2表达对骨肉瘤细胞U2-OS增殖和凋亡的影响 与si-con组比较，下调PAK2表达明显降低48 h和72 h的细胞活力、PAK2蛋白的表达量、促增殖Cyclin D1蛋白的表达量、抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量，显著提高细胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax的表达量，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而24 h的细胞活力差异不显著，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表5和图4。

表5 下调PAK2表达对骨肉瘤细胞U2-OS增殖和凋亡的影响（x-±s，n=6）

图4 骨肉瘤细胞中PAK2、Cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白表达

2.5 过表达PAK2能部分逆转miR-424对骨肉瘤U2-OS细胞的增殖和凋亡的影响 转染24 h后，miR-con组与miR-424组细胞的吸光度值差异不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)。转染48 h和72 h后，miR-24组较miR-con组细胞的吸光度值显著下降，细胞的凋亡率显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)；PAK2蛋白和促增殖蛋白Cyclin D1和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显下降，促凋亡蛋白Bax的表达量明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。转染24 h后，miR-424+pcDNA组与miR-424+pcDNA-PAK2组的细胞吸光度值差异不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)，转染48 h和72 h后，miR-424+pcDNA-PAK2组较miR-424+pcDNA组细胞吸光度值显著升高，细胞的凋亡率显著下降；PAK2蛋白和促增殖蛋白Cyclin D1和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显升高，促凋亡蛋白Bax的表达量明显下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表6和图5。

图5 骨肉瘤细胞中PAK2蛋白表达

表6 过表达PAK2逆转miR-424表达对骨肉瘤细胞U2-OS增殖和凋亡的作用(±s，n=6)

表6 过表达PAK2逆转miR-424表达对骨肉瘤细胞U2-OS增殖和凋亡的作用(±s，n=6)

注：与miR-con组比较，aP＜0.05；与miR-424+pcDNA组比较，bP＜0.05。

组别 细胞活力(OD490 nm)细胞凋亡率(%)PAK2Cyclin D1Bcl-2Bax miR-con组miR-424组miR-424+pcDNA组miR-424+pcDNA-PAK2组F值P值24 h 0.36±0.04 0.34±0.03 0.31±0.03 0.34±0.04 2.040 0.141 48 h 0.77±0.06 0.49±0.04a 0.44±0.05 0.61±0.06b 45.788＜0.05 72 h 0.88±0.07 0.57±0.06a 0.54±0.05 0.68±0.07b 35.761＜0.05 8.53±0.63 19.25±1.12a 22.38±1.88 15.33±1.05b 136.079＜0.05 0.83±0.07 0.57±0.06a 0.54±0.05 0.68±0.07b 26.013＜0.05 0.88±0.08 0.49±0.04a 0.45±0.04 0.61±0.05b 74.628＜0.05 0.85±0.07 0.62±0.06a 0.51±0.05 0.72±0.07b 31.648＜0.05 0.47±0.07 0.79±0.06a 0.81±0.05 0.63±0.07b 37.987＜0.05

3 讨论

骨肉瘤是青少年最常见的恶性骨肿瘤，易发生早期转移，致死率和致残率较高[9-10]。目前对于骨肉瘤的治疗多采用手术治疗结合化疗、放疗的综合疗法，但是骨肉瘤手术治疗致残率高、假体功能差，放疗和化疗毒副作用大，并且晚期肿瘤对化疗药耐受，导致骨肉瘤患者的生存率低，治疗效果不尽人意[11]。因此，寻找一种治疗骨肉瘤效果好、可行性大且不良反应小的临床新方法已成为目前研究的热点。

近年研究表明，miRNA是肿瘤发生发展中最基本的参与者，在肿瘤进展中发挥着关键作用。miRNA主要通过与靶基因mRNA 3'非编码区(3'untranslated region，3'UTR)完全配对促使靶基因mRNA发生降解，或不完全配对抑制mRNA的翻译但不影响其稳定性，从而调控靶基因的表达，进而影响肿瘤细胞增殖、凋亡、分化、浸润及转移等[12]。miRNA可作为癌症发生发展的指标，所以探寻与癌症相关的miRNA及下游靶基因有利于癌症的诊断与治疗。刘萍等[13]发现miR-424与肿瘤的发生、发展、治疗及预后关系密切。严贝芬等[14]发现miR-424-5p通过下调Bcl-2的表达抑制人肺癌细胞的增殖，李宏敏等[15]发现miR-424能够通过调控E2F6而抑制非小细胞肺癌细胞的生长和侵袭，孙雪梅等[16]发现miR-424a通过与ARK5 mRNA 3'UTR结合抑制胶质瘤细胞的侵袭。据研究报道，miR-424在骨肉瘤细胞中抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡[5-6]，本文通过RT-PCR法和Western blot法检测发现，与健康成骨细胞相比，骨肉瘤细胞中miR-424的表达下调，提示其可能在骨肉瘤中起抑癌基因的作用。过表达miR-424细胞活性显著下降，凋亡率显著升高，且促增殖蛋白Cyclin D1、抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显下降，促凋亡蛋白Bax的表达量明显升高，结果与此前研究一致，但其具体分子机制尚不清楚。

据研究报道，p21激活激酶2(PAK2)在多种肿瘤中异常表达，可参与细胞骨架重构、细胞凋亡、信号传导等，在肿瘤的发生和发展中起到重要作用[17]。PAK2在乳腺癌、胃癌、头颈鳞癌、黑色素瘤及膀胱癌等癌症中充当促癌基因的功能[18-20]，但其在骨肉瘤中的作用还未有报道。本研究通过RT-PCR法和Western blot法检测，发现PAK2在骨肉瘤细胞中表达上调，沉默PAK2抑制了骨肉瘤U2-OS细胞的活性，促进细胞凋亡，且明显降低细胞中促增殖蛋白Cyclin D1、抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量，并明显升高促凋亡蛋白Bax的表达量，其对骨肉瘤细胞的影响与miR-424恰好相反。本实验利用生物信息预测miR-424与PAK2之间的关系，结果表明miR-424与PAK2之间存在结合位点。荧光素酶基因报告试验进一步验证，发现miR-424与PAK2之间存在靶向调控关系，提示PAK2是miR-424的下游靶基因。同时，过表达miR-424明显减少PAK2的表达量，而沉默miR-424明显升高PAK2的表达量，证实miR-424可负向调控PAK2的表达。此外，研究发现PAK2可以逆转miR-424对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用，以及对细胞凋亡的促进作用。这些结果说明miR-424抑制骨肉瘤细胞增殖，并促进细胞凋亡可能是通过靶向调控PAK2表达来实现的。

综上所述，miR-424可通过抑制PAK2的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖、诱导其细胞凋亡。本文明确了miR-424和PAK2对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨了miR-424可通过调控PAK2的表达发挥抗肿瘤作用的可能机制，为临床治疗骨肉瘤提供了可靠的理论依据和新的治疗思路。