食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因及其表达检测

2020-01-16施春雷

中国食品学报 2020年1期

张婧张易施春雷

（上海交通大学农业与生物学院中美食品安全联合研究中心上海 200240）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种具有较强攻击性的常见人类病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种医院感染和社区感染性疾病，轻者引起化脓性皮肤感染，严重时甚至导致各种危及生命的并发症，如菌血症和心内膜炎[1]。金黄色葡萄球菌在环境中分布广泛，对外界不利环境如干燥、低温等有较强的抵抗能力，极易通过各种途径污染食品，会引发金黄色葡萄球菌食物中毒（S.aureus food poisoning，SFP），对食品安全和人类健康造成重大威胁。当金黄色葡萄球菌污染食品后，会在适宜的环境条件下大量繁殖，与此同时分泌各种毒素或毒力因子，如金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SE），大大增加了其侵袭性和致病力。消费者食用了被金黄色葡萄球菌污染的食品后便会引起SFP[2]，主要的中毒症状为腹泻、恶心、呕吐等，中毒严重者还会出现胃肠痉挛，体内水平衡失调甚至虚脱，脱水等症状[3]。根据美国疾病预防控制中心的研究报道[4]，每年在美国由金黄色葡萄球菌导致的食物中毒约有24万人次，其中1 000多人需要住院治疗并约10人因此死亡，由该菌引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%；在加拿大，这个比例高达45%[5]。我国每年也会发生多起该类食品安全事件，给医疗卫生造成巨大压力。

据报道，由5种传统肠毒素SEA～SEE引起的金黄色葡萄球菌食物中毒占比高达95%[6]。来自许多不同国家和地区的研究显示，SEA是引起金黄色葡萄球菌食物中毒事件的最主要的肠毒素[7]。不同的金黄色葡萄球菌菌株会分泌不同类型的肠毒素，即使分泌同一种肠毒素，其产生量往往也会因生长环境不同而有差异[8]。鉴于肠毒素的多样性和多变性，以及其产生的普遍性，由肠毒素导致的金黄色葡萄球菌食物中毒在治疗和防御上都有很大难度，因此一直以来都是食源性污染监测的重点对象。本研究对比不同菌株、不同肠毒素基因的携带及其表达情况，有助于进一步分析肠毒素表达的环境条件，加强产肠毒素金黄色葡萄球菌的防范和控制，同时可为食品安全监控和风险评估提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

1）金黄色葡萄球菌食源性分离株：33株金黄色葡萄球菌食源性分离株，分离自2014年9月至2015年5月采集的上海市市售食品样品。分离和鉴定方法按照《金黄色葡萄球菌检验方法》（GB4789.10-2010）第一法对采集的样品中污染的金黄色葡萄球菌进行选择性分离，对疑似菌株用PCR技术扩增nuc1基因对其做进一步鉴定[9]。

2）肠毒素阳性对照菌株：ATCC8095（携带sea、sed基因）；ATCC14458（携带seb基因）；ATCC27664（携带see基因）；I073（携带sec基因），均为本实验室保藏。

1.1.2 主要设备与仪器 Mastercycler型全自动PCR扩增仪、5810 R型高速微量台式离心机、Thermomixer comfort型恒温混匀器，德国Eppendorf；EPS 2A 200型电泳仪，美国Harvard Hoefer；GIS2020型紫外凝胶成像系统，上海天能；ES-315型灭菌锅，日本TOMY；Mili-Q超纯水系统，美国Mili-Q；HZ-8211K型恒温摇床，太仓科教仪器；HPP 260型恒温培养箱，德国Memmert；CA-1480-2型垂直层流洁净工作台，上海上净；Forma 900 Series型-80℃超低温冰箱，美国Thermo Fisher。

1.1.3 主要试剂

1）TE 缓冲液：10mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；1 mmol/L EDTA（pH 8.0）；121℃灭菌15min，4℃储存备用。

2）引物（上海生工）开盖前先12 000 r/min离心30 s，按使用说明加入一定量的TE缓冲液溶解，使其终浓度为100mmol/L，-20℃保存备用，使用时以无菌纯水稀释10倍至终浓度10mmol/L。

3）混合溶菌酶溶液：用TE缓冲溶液溶解溶菌酶（Lysozyme，美国Sigma 62970）和溶葡萄球菌酶（Lysostaphin，美国Sigma L7386），配制成质量浓度为20mg/mL溶菌酶、5mg/mL溶葡球菌酶的混合酶溶液，-20℃保存备用。

4）TIAN amp细菌基因组DNA提取试剂盒（上海天根）。

5） Taq DNA 聚合酶、dNTP、PCR buffer（大连宝生物）。

6）3MTMTecraTM微孔板法葡萄球菌肠毒素ID快速检测试剂盒（3M中国有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的活化从-80℃超低温冰箱中取出金黄色葡萄球菌食源性分离株和肠毒素阳性标准菌株的甘油保藏管，在超净台内用移液枪吸取10 μL金黄色葡萄球菌甘油保藏液接种到TSB液体培养基中，37℃摇床培养过夜后，在超净台内用金黄色葡萄球菌菌液划平板，置于37℃培养箱中培养10～14 h，长出单菌落的平板放入4℃冰箱，保存备用。

1.2.2 基因组DNA的提取从TSB平板上挑取单菌落至TSB液体培养基中，37℃摇床培养过夜后，按照DNA提取试剂盒的说明，提取金黄色葡萄球菌食源性分离株和标准菌株的基因组DNA。

1.2.3 金黄色葡萄球菌肠毒素基因的PCR筛查根据已有的文献报道和检索GenBank数据库，设计合成了5种金黄色葡萄球菌肠毒素基因的引物序列，具体见表1。

表1 金黄色葡萄球菌5种肠毒素基因引物序列及其产物大小Table1 Primer sequences and fragment size of products of 5 enterotoxin genes

以提取的基因组DNA作为模板，PCR扩增5种金黄色葡萄球菌肠毒素基因，按比例配制反应体系：10× buffer 2.5μL，MgCl2溶液（25mmol/L）1.5 μL，dNTPs（各 2.5 mmol/L）1 μL，上下游引物（10 μmol/L）0.5 μL＋0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（1 U/μL）0.5 μL，DNA 模板 2.0 μL，无菌水 16.5 μL。扩增条件：95℃预变性 5min，95℃变性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，最后72℃延伸10min。

吸取5μL PCR扩增产物，与1μL 10×Loading Buffer混匀后，将100 bp DNA Ladder和样品点样于1.5%琼脂糖凝胶（内含万分之一核酸染料DuRed），电压 120 V，电泳时间 45min，电泳结束后使用紫外凝胶成像系统成像并观察结果。

1.2.4 金黄色葡萄球菌肠毒素表达的筛查本研究使用3MTMTecraTM微孔板法葡萄球菌肠毒素ID快速检测试剂盒进行肠毒素表达的筛查，大致试验步骤如下。

1）样品液的制备：5mL过夜培养的金黄色葡萄球菌菌液加10mL Tris缓冲液，充分混合。3 000 r/min离心10min。用注射器过滤装置过滤菌液后，调节pH值至7～8。取1mL过滤液与50 μL样品添加液，充分混合备用。

为对比环境条件对肠毒素表达的影响，本研究中分别使用了TSB培养液和食品基质（牛奶）培养得到金黄色葡萄球菌菌液进行相关检测。

2）参考试剂盒说明书配制试剂，包括洗液（Wash solution）、结合物（Conjugate）、底物（Substrate）、终止液和样品添加剂（Stop solution，Sample additive）、阳性毒素对照液（Positive control）及阴性食品对照（Negative control）的准备。

图1 5种金黄色葡萄球菌肠毒素基因的凝胶电泳图Fig.1 Electrophoresis of 5 S.aureus enterotoxin genes

3）参考试剂盒说明书进行孔板试剂盒的操作，确保使用前试剂盒内所有试剂处于室温（20～25℃）。

4）判读结果：结果可用比色卡直接肉眼判读。使用比色卡注意阳性对照必须至少达到比色卡4号颜色，并且阴性对照颜色必须浅于比色卡2号颜色，此时试验结果有效。

微孔变色说明存在肠毒素，携带肠毒素基因的菌株能够有效表达。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌肠毒素基因携带情况

携带这5种肠毒素基因的金黄色葡萄球菌标准菌株的电泳图如图1所示。

使用表1所示的5种金黄色葡萄球菌肠毒素基因的引物，对33株食源性分离株进行毒力基因筛查，得到了这些分离株中5种传统肠毒素基因的携带率，具体结果见图2。5种肠毒素基因中检出率最高的基因是seb，总携带率为48.48%（16/33），携带率最低的肠毒素是see，仅为9.09%（3/33）。其它3种肠毒素基因的携带率依次为是sec 30.30%（10/33）、sea 27.27%（9/33）和sed 15.15%（5/33）。

33株分离株中，肠毒素基因的检出率为100%，即每株分离株至少携带一种肠毒素基因，且有2株分离株（SJTUF21507、21509）同时携带有3种肠毒素基因，而有6株分离株同时携带有2种肠毒素基因。

图2 5种肠毒素基因在33株食源性分离株中的携带率Fig.2 Carrying rate of 5 enterotoxin genes in 33 foodborne S.aureus isolates

2.2 金黄色葡萄球菌肠毒素分泌情况

通过3MTMTecraTM微孔板法检测，有21株分离株出现肠毒素阳性结果，即肠毒素基因得到了有效表达，其具体试验结果见图3。在本试验中，经TSB培养基或食品基质（牛奶）培养后的金黄色葡萄球菌，其中5种肠毒素的表达情况一致。

图3 33株食源性分离株中5种肠毒素基因的携带和表达Fig.3 The carrying and expression of 5 enterotoxin genes in 33 foodborne S.aureus isolates

3 讨论

SE是由金黄色葡萄球菌所产生的一类典型的超抗原组成，它的N端肽链具有催吐活性，可引起人呕吐，是导致SFP的罪魁祸首[14]。SE引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的首位，而其中，传统肠毒素SEA～SEE是引起该类食物中毒最主要的因素，其表达与否，直接影响着菌株的致病性。SE蛋白具有显著的耐热性和耐酸性。一旦食物受到SE污染，常规的烹煮甚至高温处理并不能使其完全变性失活，而仍然保有超抗原活性，继而引起呕吐和胃肠炎等食物中毒症状。此外，SE蛋白耐胃肠蛋白酶灭活，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和凝乳酶[15]，因此可以很容易进入人体肠道中产生毒素。

在本试验中，PCR对5种传统肠毒素基因的筛查结果显示，肠毒素基因的检出率高达100%，证明其存在具有普遍性。其中，seb和sec的携带率较高，都超过30%，最低see的携带率不超过10%。值得一提的是，虽然33株食源性分离株均携带至少一种肠毒素基因，但是在3MTMTecraTM微孔板法检测的结果中，只有63.64%（21/33）的菌株肠毒素检测结果呈阳性，即有肠毒素表达。虽然有数据表示，不同的培养基质对SEs的产生也有一定影响，例如2013年Valihrach等[16]的研究证明，所有受测菌株在牛奶中产生的SEC均少于在微生物肉汤中的量。而本试验仅定性地证明了受测的33株食源性分离菌在TSB和牛奶中的SE产生情况一致，但产生的数量是否一致，还需要进一步检测。

SE基因在金黄色葡萄球菌中的表达由多个调控元件（例如：agr、arlRS和saeRS）和DNA 结合蛋白（例如：sarA家族和sigB因子）协调[17]。此外，pH值、温度、氧气、碳源、盐、金属离子和短肽等环境信号可能对毒力基因的转录有影响[18]。SE产生的环境整体范围较广，在温度10～45℃，pH 4.5～9.6，水分活度Aw 0.85～0.99 以上，NaCl质量分数介于0～10%的条件下均可产生[19]。含淀粉、蛋白质和水分较多的食品，如牛乳及乳制品、肉和蛋等，都可以为其产生提供适宜的食品基质。不同SE的产生也存在一定规律性和差异性。例如，SEA产生的pH范围较广，一般要求大于4.5，Aw＞0.86，这也是SEA在过去报道中，引起金黄色葡萄球菌食物中毒最多的主要原因。相比之下，SEB和SEC产生的pH范围较窄，均为中性，且只有在Aw＞0.96且温度适宜的情况下，SEB才能分泌产生[3]。综合而言，SE产生的最适温度为37℃，当存放在20℃以上时，温度越高，产生肠毒素时间越短；在通风不良，氧气压较低的时候，更容易形成SE[20-21]。所以，即使携带了SE基因，也不一定能够得到表达产生SE蛋白，这与本试验的结果相一致。

一般来说，SE引起食物中毒所需的剂量极少，有研究表明[15]，SEA的最低催吐剂量可达0.5 ng/mL。目前，一般的监管规定只要求对日常食品中是否存在5种传统肠毒素SEA～SEE进行检测，这也是5种肠毒素与食物中毒关系研究较多的原因。然而，截至目前，共有22种SE基因被发现，分别是sea～see、seg～sev、sey[22]。且据已有报道显示，在不少引起SFP的分离菌株中，只携带某些新型SE。这也就意味着，未来对SFP的预防和治疗过程中，也需要关注新型SE。