南方山葡萄酒的氧化褐变动力学研究

李维新 苏 昊 何志刚 * 林晓姿 任香芸 梁璋成 林晓婕

（1 福建省农产品（食品）加工重点实验室 福州 350003

2 福建省农业科学院农业工程技术研究所 福州 350003）

葡萄酒的氧化褐变是其在加工及陈酿期间极易发生的重要问题之一。葡萄酒被氧化后，酒的颜色变为褐色，酒液由澄清变为浑浊，氧化味较重，使葡萄酒的外观和营养品质均下降，甚至失去商品价值[1]。葡萄酒的氧化褐变可以分为非酶氧化褐变及酶促氧化褐变两种，酶促氧化褐变主要发生在葡萄酒加工的早期，而非酶促褐变主要发生在葡萄酒的陈酿期间[2-3]。在实际生产中，由酶促反应引起的褐变已经得到很好的控制，而葡萄酒非酶褐变的研究越来越受到人们的关注。葡萄酒氧化褐变的影响因素较多，比如空气中的氧气、酒中的酚类、金属离子、黄酮类物质以及添加的SO2等都对氧化褐变起重要作用[4-5]。酚类是葡萄酒中极易被氧化的一类物质，葡萄酒中的酚类物质尤其是邻羟基酚受铜、铁离子催化氧化生成邻醌或半醌自由基，并很快通过缩聚反应形成褐色素，而氧气被还原成过氧化氢[6-7]。红葡萄酒中主要的呈色物质如花青素、花色苷等，它们既可以影响红葡萄酒的色泽，也可以在葡萄酒抗氧化方面发挥重要作用，如它们可以清除自由基以及螯合金属离子等。另外，葡萄酒中的原花青素、花色苷等黄酮类物质在陈酿期间会发生聚合、氧化、环加成、辅色等多种复杂的化学反应而降解[8-9]。因此，花色苷、花青素在有氧和高温条件下很容易被氧化而损耗。葡萄酒的氧化褐变过程复杂，涉及的因素和反应较多，这给氧化褐变机制研究带来很多困难。目前国内外已有关于白葡萄酒氧化褐变动力学的研究[10-11]，因葡萄酒品种、类别的不同，故其研究结果不一致，而关于红葡萄酒氧化褐变动力学的研究则极少[12]。

SO2是葡萄酒生产中应用最广泛的食品添加剂，具有多重抗氧化活性，它可以加速耗氧量，通过还原减少酚类损失，阻断过氧化氢，从而防止葡萄酒的过度氧化[13]。有研究表明，葡萄酒中添加SO2的抗氧化作用机制主要是与葡萄酒的被氧化中间产物双氧水和邻醌进行反应，将氧化产物还原为酚和氧，从而达到抗氧化的目的[14]。葡萄酒中的SO2主要是以结合态和游离态两种形式存在，其中只有游离态的SO2才具有抗氧化作用，结合态SO2只有在释放成游离态时，才具有抗氧化功能。葡萄酒中游离SO2的变化往往伴随着氧化还原电位（ORP）的变化。本研究以福建省农产品（食品）加工重点实验室研发的桂葡1号葡萄酒和刺葡萄酒为对象，分析其在加速氧化褐变过程中褐变程度、游离SO2及ORP变化以及对主要品质的影响，研究南方山葡萄的氧化褐变动力学，游离SO2及ORP含量变化及其互作关系，从而为有效防止葡萄酒在加工过程中的过度氧化褐变，防止葡萄酒在陈酿期间的品质劣变等方面提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄酒，福建省农产品（食品）加工重点实验室2015年加工的桂葡1号葡萄酒和刺葡萄酒，均为干型红葡萄酒，试验样酒的理化指标见表1。

表1 试验样酒的主要理化指标Table1 Physicochemical indexes of wines

试剂：盐酸、正丁醇、醋酸、氯化钠、醋酸钠、香草醛、二甲基亚砜等试剂均为分析纯级。原花青素（纯度UV≥95%），四川维克奇生物科技有限公司；芦丁（纯度UV≥95%），国药集团化学试剂有限公司。

仪器：UV-1750紫外可见分光光度计，日本岛津公司；868型酸度计，ORION公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；FJA-6型去极化自动氧化还原电位测定仪，南京传滴仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄酒的加速氧化褐变方法 参考Sioumis等[5]的方法，并略微调整：在250mL的玻璃试剂瓶中，加入100mL试验葡萄酒样品，加盖密闭后放置于（50±1）℃的恒温箱中，避光处理30 d。每个试验处理重复3次，在处理后的第1，2天分别取样一次，第3天起每7天取样一次，检测褐变程度、红色色调、游离SO2、氧化还原电位等指标。在加速氧化开始前和结束时取样检测葡萄酒的总酸、挥发酸、原花青素、游离花色苷、总酚等主要理化指标。

1.2.2 葡萄酒样褐变程度的测定方法 葡萄酒样在测定前用0.45μm有机相针式过滤，处理后的葡萄酒用柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液10倍稀释。葡萄酒的褐变程度以波长420 nm下的吸光值来表示，葡萄酒的红色色调用波长520 nm下的吸光值来表示。样品置于石英比色皿（光程1 cm）中，利用紫外-可见光分光光度计测定吸光值。

缓冲溶液的配制：将0.1mol/L的柠檬酸75 mL与0.2mol/L的磷酸钠25mL进行混合，在使用前经过0.45μm有机相针式过滤，且每次现配现用。

1.2.3 葡萄酒样主要理化指标的检测 酒样中酒度、还原糖、总酸、挥发酸、游离SO2、总酚、pH值等指标的测定，参考的《葡萄酒分析与检验》[15]。

酒样中的游离花色苷测定方法参考陈琼和霍琳琳等[16-17]的方法，并做以下修改：待测葡萄酒样分别用 HCl-NaCl缓冲液（pH 1.0）和HAc-NaAc缓冲液（pH 4.5）稀释50倍后，将稀释好的酒样分别在700 nm和最大吸收波长处测定吸光度，检测以蒸馏水作为对照。样品吸光值A的计算公式为：

酒样的游离花色苷以矢车菊素-3-葡萄糖苷（CGE）表示，其计算公式如下：

式中，Mw——矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量（449.6）；DF——稀释倍数；ε——摩尔吸光系数（29 600）。

原花青素含量测定参考吴巍等[18]的方法。

氧化还原电位（ORP）采用去极化氧化还原电位测定仪进行测定。

1.3 试验数据的处理

试验数据采用数据处理软件DPS（V 7.05）进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 2种南方山葡萄酒氧化褐变及其动力学分析

在加速氧化过程中，2种南方山葡萄酒的褐变程度（A420）一直增强，至加速氧化30 d，桂葡1号葡萄酒的A420自开始的0.2668增加到0.4783，提高了79.27%；刺葡萄酒的褐变程度增强更快，提高了111.97%（图1）。从葡萄酒氧化过程中红色色调的变化来看，在氧化1 d后，2种葡萄酒的红色色调略有上升，之后急速下降。至氧化30 d，桂葡1号葡萄酒的红色色调下降了52.03%，而刺葡萄酒下降了23.39%（图2）。氧化1 d后葡萄酒的红色色调略微上升，可能是葡萄酒中游离SO2被氧化后，被SO2结合的花色素释放出来的结果。葡萄酒中游离SO2可以和酒中的花色素结合，生成无色的亚硫酸色素化合物，从而使葡萄酒的色泽变浅，当酒体中有乙醛存在或SO2被消耗时，该不稳定化合物分解，使葡萄酒的颜色变深[3]。

回归分析表明，2种葡萄酒的褐变程度随褐变时间的变化符合0级动力学模型方程：[A420]=[A420]0+kt，[A420]0表示初始的褐变程度，k为褐变系数。其中，桂葡1号葡萄酒和刺葡萄酒的动力学方程分别为：Y1=0.3189+0.0059t1，R2=0.9168（P=0.0037）和Y2=0.2965+0.0093t2，R2=0.9577（P=0.0002）；桂葡1号葡萄酒的褐变系数（0.0059）比刺葡萄酒（0.0093）小，表明桂葡1号葡萄酒总体的耐氧化能力要高于刺葡萄酒。从红色色调的变化上看，刺葡萄酒经过30 d的氧化后，其最终的红色保持能力要高于桂葡1号葡萄酒（图2）。

图1 南方山葡萄酒氧化过程中褐变程度的变化Fig.1 Changes of browing degree in southern wild wines during the oxidation

2.2 南方山葡萄酒氧化褐变过程中游离SO2和氧化还原电位的变化

葡萄酒中游离的SO2具有抗氧化和抑菌作用，能够参与葡萄酒中一些氧化反应，例如：SO2可以阻止葡萄酒中乙醛和H2O2参与丹宁和游离花色苷的缩合反应，从而抑制葡萄酒的变色[13]。在葡萄酒加速氧化前期，SO2被氧化消耗较快；氧化处理1 d后，2种葡萄酒的游离SO2含量均迅速下降到7mg/L左右的较低水平。在第9天，2种葡萄酒中的游离SO2略有回升，可能是葡萄酒中原先存在的结合态SO2在游离硫被消耗的情况下，释放出少量游离态SO2导致[19]。到第16天，2种葡萄酒中的游离SO2均下降到3.92mg/L，虽然酒样中的游离SO2不能够被全部消耗，但此时其抗氧化能力较弱（图3）。

同一种葡萄酒在较高游离SO2含量的情况下，游离SO2是影响其氧化还原电位的主要因素。在葡萄酒加速氧化过程中，2种葡萄酒的氧化还原电位在第1天迅速增加，可能有两个方面的原因：一是葡萄酒中的游离SO2被迅速消耗从而导致氧化还原电位上升，二是葡萄酒中的酚类物质如单宁等被氧化为邻醌，并伴随着H2O2的生成而使氧化还原电位上升。在第2～9天，2种葡萄酒的氧化还原电位略有下降，随后上升并保持较为稳定的高水平（图4）。氧化还原电位在氧化中期下降，可能与葡萄酒在游离SO2减少的情况下少量释放结合态的SO2有关。

桂葡1号葡萄酒和刺葡萄酒在加速氧化过程中的游离 SO2（Y1、Y2）与氧化还原电位（X1、X2）呈显著负相关关系：Y1=141.738-0.3053X1，P=0.0022，相关系数 R=-0.9571；Y2=454.130-1.092X2，P=0.0001，相关系数R=-0.890；此试验结果表明葡萄酒中的氧化还原电位能够间接反映出酒中游离SO2的变化。

图2 南方山葡萄酒氧化过程中红色色调的变化Fig.2 Changes of red hue in southern wild wines during the oxidation

图3 南方山葡萄酒的氧化褐变过程中游离SO2的变化Fig.3 Changes of free sulfur dioxide content in southern wild wines during the oxidation

2.3 氧化褐变对南方山葡萄酒主要品质的影响

图4 南方山葡萄酒氧化褐变过程中氧化还原电位的变化Fig.4 Changes of redox potential in southern wild wines during the oxidation

南方山葡萄酒在加速氧化30 d后，其主要的理化指标变化见表2。2种葡萄酒的pH值均下降，下降幅度在0.13～0.15之间。pH值的下降同葡萄酒中褐色素的分解及挥发酸、总酸的升高有关。葡萄酒中酚类是极易被氧化的一类物质，在有氧情况下，酚类物质可以氧化生成醌和H2O2，进而通过缩聚反应形成褐色素，使葡萄酒的A420迅速增加。桂葡1号葡萄酒和刺葡萄酒在加速氧化30 d后，总酚含量均显著下降，桂葡1号的总酚由1.22 g/L减少到1.01 g/L，下降了17.2%，而刺葡萄酒下降了16.3%。花青素、花色苷是红葡萄酒中主要的呈色物质，它们不但对葡萄酒的颜色和口感产生影响，还具有较强的抗氧化作用。在葡萄酒加速氧化过程中，酒体中的游离花色苷、原花青素下降较多，桂葡1号葡萄酒氧化30 d后，其原花青素自3.06 g/L下降到1.26 g/L，下降了58.82%，刺葡萄酒则下降了44.40%；2种葡萄酒的游离花色苷在氧化30 d后损耗严重，桂葡1号葡萄酒从开始的431.07mg/L下降到31.67 mg/L，刺葡萄酒的从269.61mg/L下降到24.83mg/L，损失率均超过90%。而刺葡萄酒在经过30 d的加速氧化后其原花青素含量为1.49 g/L，比南国1号葡萄酒1.26 g/L高出0.23 g/L，这也可能是刺葡萄酒在氧化后其红色色调高于桂葡1号葡萄酒的主要原因。

表2 南方山葡萄酒氧化30 d前、后主要指标的变化Table2 Changes of the main physicochemical indexes in southern wild wines after 30 days oxidation

3 结果与讨论

桂葡1号葡萄酒和刺葡萄酒是福建省农产品（食品）加工重点实验室研发的2款南方山葡萄酒，它们在营养特征、有机酸结构、香气成分等方面均与北方葡萄酒不同。本文对这两款山葡萄酒的功能性评价、营养分析、品质控制技术等方面分别进行了研究[20-21]。结果表明，2种南方山葡萄酒随加速氧化时间的延长，其褐变程度一直呈上升趋势，其氧化褐变规律均符合0级动力学模型，这与Sioumis等[5]和Francisco等[11]的研究结果相似，而与梁莎等[12]在“媚丽”葡萄酒上的研究结果不一致，可能是葡萄酒品种的差异，以及加速氧化方法中酒样量和空气比例略有区别的缘故。本研究是在250mL玻璃瓶中装入100mL的葡萄酒样并密封，在试验前期，瓶中含有较多氧气，葡萄酒急速氧化。葡萄酒中的某些酚类物质消耗氧的速度比SO2更快，SO2主要是与葡萄酒被氧化的中间产物邻醌和H2O2进行反应[13，22]。因此在加速氧化的第1天，桂葡1号葡萄酒（含游离SO221.29mg/L）和刺葡萄酒（含游离SO223.80mg/L）的SO2都被迅速消耗。之后，葡萄酒中游离SO2的含量始终保持较低水平，虽然其不会被彻底消耗完，但抗氧化作用已大大降低甚至失去抗氧化能力。这个结论表明，葡萄酒中游离SO2虽对其具有一定的抗氧化作用，但如果葡萄酒在高温和高氧环境下，仍然不可能避免发生氧化损失。因此，葡萄酒在加工及贮藏过程中，在保持适宜游离SO2含量的情况下，还必须采取低温、隔氧的贮藏方法，综合防治葡萄酒的过度氧化。

葡萄酒中一般存在多种氧化还原电位，从而构成复杂的氧化还原体系，而葡萄酒中的氧化还原电位则是葡萄酒中存在的诸多氧化物质和还原物质之间，发生复杂化学反应的综合结果。葡萄酒中的氧化还原电位能够反映葡萄酒中氧化还原能力，这有助于了解葡萄酒的电化学性质，进而对葡萄酒的氧化进程进行分析，而葡萄酒的品种、游离SO2、离子、温度、pH值等均能影响葡萄酒的氧化还原电位[10]。本试验结果表明，在南方山葡萄酒的加速氧化过程中，游离SO2的变化与氧化还原电位呈显著负相关。氧化还原电位的检测方便快捷，而游离SO2的检测较繁琐。因此，深入研究葡萄酒中氧化还原电位和游离SO2含量之间的关系，对于利用葡萄酒中的氧化还原电位快速监测游离SO2含量有着重要的研究意义。

与葡萄酒的质量息息相关的多酚化合物不仅影响酒的口感，还与葡萄酒的色泽相关，而且还具有较强的抗氧化能力，如螯合金属离子、清除自由基等[23]。在葡萄酒贮藏期间，酒体中的酚类物质可以相互之间发生环加成、氧化、聚合等多种化学反应。另外，葡萄酒中的多酚类物质还具有还原性，可以消耗酒体中60%的氧气[24]。因此，在南方山葡萄酒加速氧化结束后，总酚的含量下降较多。游离花色苷和原花青素是葡萄酒中的一大类多酚化合物，其含量、种类、结构及聚合度与葡萄酒的品质密切相关。葡萄酒中的游离花色苷在贮藏期间能够转化为相对稳定的多聚化合物和低聚体，还能够同花色素-乙烯基苯酚、花色素-丙酮酸等物质进行缩合反应，并受到酒体中溶解氧含量的影响；葡萄酒中的原花青素能够消耗氧从而有效防止葡萄酒中其它物质被氧化，并对葡萄酒的颜色稳定和葡萄酒的涩味、苦味和结构感起到重要作用[25]。在本试验条件下，2种葡萄酒的原花青素经过30 d的加速氧化后损失均超过了44%，而游离花色苷几乎损失殆尽，导致葡萄酒红色色调下降，营养物质损失，并产生不利的氧化物质，从而影响了葡萄酒的风味和品质。因此对葡萄酒在加工陈酿期间游离花色苷、原花青素等抗氧化类物质有效控制，也是提高葡萄酒品质的重要途径之一。