鳜鱼下脚料酶解物对冷冻鳜鱼的保水作用

黄 琼 方旭波* 李 莹 周剑忠 陈小娥 夏伟荣

（1 浙江海洋大学食品与医药学院 浙江舟山 316022

2 江苏省农业科学院农产品加工研究所 南京 210014）

鳜鱼又名桂花鱼，在分类学上属于硬骨鱼类（Osteichthyes），鲈形目（Perciformes），鱼旨科（Serranidae），鳜亚科（Sinipercinae），鳜鱼属（Siniperca Gill）[1]。鳜鱼以肉质细嫩丰满，肥厚鲜美，营养丰富，内部无胆，少刺而著名，是一种名贵的淡水鱼类[2]。鳜鱼季节性强，大多以鲜活销售，一旦滞销，将造成极大的浪费。冷冻保藏可最大限度地保持鳜鱼的营养价值和风味品质，然而在冻藏过程中产生的冰晶，易使鳜鱼肌肉细胞受损，蛋白质变性，增加解冻时的汁液流失，导致其风味和营养价值下降[3]。

传统保水剂多采用复合磷酸盐保持产品嫩度，然而由于磷酸盐易被水解，影响保水效果，因此一些不良商家违规操作，常过量添加磷酸盐[4]，影响产品的品质甚至影响消费者健康，导致消费者机体钙磷比例失衡（即影响机体钙磷代谢）[5]，而钙磷代谢平衡被打破后会造成佝偻病、骨质疏松等代谢性骨病。因此，开发新型无磷保水剂，避免磷酸盐过量添加导致人体健康损害的研究，具有重要现实意义[6]。

目前，国内外对于新型无磷保水剂的研究已有报道[7-8]，主要为卡拉胶寡糖[9]、海藻糖[10]、变性淀粉[11]、大豆蛋白[12]等。利用水产品加工废弃物酶法获得磷酸盐替代物作为保水剂，不仅使废弃物得到充分利用，而且方法绿色安全。Shanidi等[13]将肉糜混合一种蛋白酶解物后加热，发现蒸煮损失率在一定程度上降低，产品的保水性也得以改善，原因可能是蛋白酶解物中丰富的游离氨基酸可使肉类的肌原纤维蛋白结构更加稳定，从而达到保水的效果；Mohammed等[14]发现蛋白水解物（FPH）可以通过提高Ca2+-ATPase活性、凝胶强度等方面延缓鱼肉蛋白质变性程度。

本试验以鳜鱼鱼肉为研究对象，利用低场核磁共振分析仪、质构仪、扫描电镜分别测定鳜鱼鱼肉经不同保水剂处理冻藏后的水分状态、组织特性以及微观结构，评价鳜鱼下脚料酶解物对鳜鱼的保水效果，以期减少冷冻鳜鱼的汁液流失，保障产品品质，既实现了加工副产物的再利用，也为冷冻水产品新型保水剂的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活鳜鱼，南京嘉鸿水产商行，均重（500±50）g。将鲜活鳜鱼置于含冰的泡沫箱内，30min内运回实验室。

中性蛋白酶（1×106U/g），上海源叶生物科技有限公司；三聚磷酸盐，河南思远生物科技有限公司；食盐，市售食品级；2.5%戊二醛、无水乙醇等所有试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

低温试验箱（DW-150），南京泰斯特试验设备；医用低温保存箱（DW-4 OL 278），海尔；紫外分光光度计（UV-1600 PC），上海美谱达；匀质分散机（T 25），德国IKA公司；高速离心机（3 K15），德国Sigma公司；质构仪（TVT-300 XP），美国FTC公司；低场核磁共振仪（PQ001），上海纽迈；扫描电子显微镜（EVO-LS 10），德国卡尔蔡司。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白质含量测定 采用双缩脲法（Biuret法）[15]测定蛋白质浓度。以牛血清蛋白为标准蛋白，绘制标准曲线，线性回归方程为Y=0.05x-0.0033，R2=0.9992。

1.3.2 原料预处理 将鳜鱼鱼鳔和鳜鱼鱼皮、鱼骨分别洗净后剪成小块干燥，备用。将原料浸入5%食盐溶液中搅拌24 h，料液比1∶10，期间更换1次浸泡液，离心，用蒸馏水清洗沉淀8～10次。在冲洗后的鳜鱼鱼鳔和鳜鱼鱼皮、鱼骨中加入去离子水使料液比为1∶8，在85℃水浴中恒温浸提6 h，4 000 r/min离心10min，取上清液即为酶解底物，待用。

1.3.3 鳜鱼副产物蛋白酶解液的制备[16]将上述鳜鱼鱼鳔和鱼皮鱼骨浸提液预热至37℃，调节pH值至7.0，加入一定量中性蛋白酶进行酶解。待酶解结束后，于95℃水浴中灭酶10min，冷却后3 000 r/min离心10min，取上清液。将酶解液减压浓缩，并用双缩脲法测定蛋白浓度[15]，统一蛋白质质量浓度为83.34mg/mL。

1.3.4 浸渍液处理设计 浸渍液设计见表1。在低温条件下，将新鲜鳜鱼去头、去骨、去皮，用锋利小刀切成40mm3大小，洗净沥干并用纱布拭干水分，给各组鳜鱼鱼肉编号后称量并记为A1（精确至0.001 g，下同），将上述浸渍液预冷至0℃，在4℃浸泡2 h每隔20min搅拌1次，再次沥干并用纱布拭干水分，称质量记为A2。将浸泡称重后的鳜鱼移至低温试验箱速冻至中心温度-40℃后，迅速置于-40℃冰箱中，每隔24 h反复冻融1次，反复冻融2次后测定各指标。

表1 不同浸渍液对鳜鱼鱼肉的处理设计Table1 Treatment design of different maceration extract on mandarin fish

1.3.5 浸泡增重率、解冻损失率、蒸煮损失率的测定 选择鳜鱼背部肌肉作为试验对象，10℃条件下，以料液比1∶2，浸泡2 h后，沥水，称重，计算样品的浸泡增重率[17]。设置3个平行，结果取平均值。按下式计算浸泡增重率：

式中，A2——鱼肉浸泡后的质量，g；A1——鱼肉原始质量，g。

解冻损失率测定：取出冻藏的鱼肉置于室温下自然解冻2 h，沥水，称重。按下式计算解冻损失率：

式中，A2——鱼肉浸泡后的质量，g；A1——鱼肉解冻后的质量，g。

蒸煮损失率的测定：将测定解冻损失率后的样品，于沸水中蒸煮10min，冷却至室温后沥水，称重。按下式计算蒸煮损失率[17]：

式中，A1——鱼肉蒸煮前的质量，g；A2——鱼肉蒸煮后的质量，g。

1.3.6 质构特性的测定 根据Tolasa等[18]的方法使用质构分析仪测定硬度、弹性和咀嚼性。样品处理：挑选鳜鱼背部肌肉，调整鱼肉大小至20mm3，室温下静止30min，p/30平底柱形探头，探头下降速率 3mm/s，测试速率1mm/s，返回速率 1mm/s，样品压缩形变量50%。

1.3.7 肌肉中水分的分布与组成测定 采用低场核磁共振分析仪测定冷冻鳜鱼肌肉水分分布，试验方法参考Sánchez等[19]略有改动。取质量约2.5 g的样品放入核磁测定管内，设置参数：半回波时间为100μs，扫描次数为8次，重复时间为3 000 ms，利用核磁共振时间反演拟合软件得到关于T2的图像。

1.3.8 扫描电镜分析[20]样品室温化冻后，调整其大小至1mm3，浸没于2.5%戊二醛溶液中，并置于4℃冰箱内固定3 h以上，随后用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，每次15min。将样品在30%，50%，70%，80%，90%梯度体积分数的酒精中依次脱水，每个梯度放置15min，脱水完毕后，使用无水乙醇脱水3次，每次30min。将脱水后的样品放入叔丁醇中置换2 h或更长时间，置于冷冻干燥仪中进行干燥以脱去样品中剩余的水分。样品喷金后，通过扫描电镜进行观察。

1.4 数据处理

试验重复3次取平均值，并用平均值±标准差表示，采用SPSS13.0软件进行数据统计和方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同保水剂对冷冻鳜鱼鱼肉保水性的影响

表2从浸重率、解冻损失率、蒸煮损失率反映了试验中不同保水剂处理对鳜鱼保水性的影响。经过保水剂浸泡后，鳜鱼鱼肉质量均在不同程度上增加。空白组（蒸馏水）处理的样品浸重率为1.38%，4%STPP处理组浸重率为6.03%，鳜鱼鱼鳔酶解液处理组和鳜鱼鱼皮鱼骨酶解液处理组差异不显著（P＞0.05）。鳜鱼鱼鳔酶解液+2.5%食盐复配组显著优于单一的食盐组，与4%STPP组差异不显著（P＜0.05），这说明鳜鱼鱼鳔酶解液+2.5%食盐复配处理鳜鱼保水效果显著。

在冻藏期间，肌肉细胞内水分流失主要是因为其微观结构发生了变化，肌肉细胞中生成的冰晶会使蛋白质挤压聚集。蒸馏水（空白组）处理后解冻损失率为14.30%，各保水剂处理组的解冻损失率均小于单一食盐处理组。4%STPP处理的鳜鱼鱼肉解冻损失率最小，与鳜鱼鱼鳔酶解液+2.5%食盐处理组差异不显著。

鱼肉保水性能的优劣也可以用蒸煮损失率衡量，蒸煮损失率较低，保水性较好。蒸煮后，鳜鱼鱼肉的蒸煮损失率约为5%～15%，保水剂处理后的样品具有较低的蒸煮损失率，可以看出保水剂处理鱼肉可以使蒸煮损失率降低，从而达到保水的效果。4%STPP处理的样品组具有最低的蒸煮损失率，因为STPP处理后，肌原纤维蛋白被剧烈破坏，肌球蛋白从肌原纤维所形成的网状结构中脱离，可溶性蛋白质含量增加。在加热过程中，肌肉中的水因肌球蛋白凝胶的形成而被固定[21]。鳜鱼鱼鳔酶解液+2.5%食盐复配组处理的样品效果显著，与 4%STPP处理效果差异不显著（P＞0.05），说明鳜鱼鱼鳔酶解液与食盐协同与蛋白质作用，对减少鱼肉水分的散失具有积极作用。

2.2 质构分析

由表3可以看出，经过两次反复冻融后鳜鱼鱼肉硬度、弹性、咀嚼性均有所下降，质构特性恶化。在贮藏期间，肌肉组织被破坏可能是由于蛋白质被挤压变性，其空间结构发生改变，在解冻过程中汁液的流失也会导致鳜鱼鱼肉硬度、弹性及咀嚼性下降。弹性下降也与鱼体死后的自身降解和微生物分解有关[22]。各保水剂浸泡处理组的鳜鱼鱼肉弹性均显著优于蒸馏水（空白）组（P＜0.05）。其中鱼鳔酶解液+2.5%食盐复配浸泡处理组的弹性值为0.453，与 4%STPP组无显著差异（P＞0.05），与新鲜组差异最小。另外，经过两次反复冻融后，鳜鱼肌肉的组织结构被破坏，导致咀嚼性下降。保水剂处理组的鳜鱼咀嚼性均显著优于蒸馏水（空白）组，其中以鳜鱼鱼鳔酶解液+2.5%食盐复配浸泡处理效果最佳，与4%STPP处理组差异不显著（P＞0.05），说明鳜鱼鱼鳔酶解液+2.5%食盐复配浸泡处理鳜鱼鱼肉冻藏后水分流失较少，细胞间空隙小，水分结合力较大。本试验中，鱼鳔酶解液+2.5%食盐复配处理鳜鱼在一定程度上缓解了肌肉蛋白质的冷冻变性，进而减缓了鳜鱼鱼肉质构品质的下降程度。

表2 不同保水剂对冷冻鳜鱼肉保水性的影响Table2 Effect of weight gain，cooking loss，and cooking yield with various treatments of freeing mandarin fish

表3 不同保水剂处理的冷冻鳜鱼肉硬度、弹性、咀嚼性的变化Table3 Hardness，springiness and chewiness of freezing mandarin fish with various treatments

2.3 低场核磁分析

低场核磁共振横向弛豫时间T2可作为衡量肉类结构持水能力的指标[23]。利用硬脉冲CPMG序列测定样品的自旋-自旋弛豫时间T2。鱼肉中的水分含量为70%～80%，这些水分有3种存在形式，即结合水T21，可移动水T22及自由水T23[24]。水产品的食用品质主要取决于肌肉细胞对可移动水的持有能力，这部分水分约占水分总量的80%左右[25]，对鱼肉的结构、外观和感官有很大影响。可移动水T22积分面积与肌纤维结构中截留的水分呈正相关，面积越大，水分越多，产品的保水性更好。

如图1所示，保水剂处理的样品组可移动水T22积分面积显著高于空白处理组，说明添加保水剂可以有效控制鱼肉肌纤维中可移动水含量的减少，显著提高鳜鱼鱼肉的保水性（P＜0.05）。鳜鱼鱼鳔酶解液+2.5%食盐处理组样品组T22积分面积显著高于4%STPP组（P＜0.05），说明鳜鱼鱼鳔酶解液+2.5%食盐处理鳜鱼鱼肉可有效提高其保水性。鳜鱼鱼鳔酶解液处理组和鳜鱼鱼皮、鱼骨酶解液处理组与2.5%食盐处理组的积分面积差异不显著（P＞0.05）。从图2可以看出，鳜鱼鱼鳔酶解液+2.5%食盐处理组的核磁共振谱图与空白及单一食

图1 不同保水剂处理的冷冻鳜鱼可移动水（T22）的峰面积Fig.1 The peak area integration（T22） of freezing mandarin fish with different treatments

2.4 电镜分析

鱼的肌肉组织主要由肌细胞构成，肌细胞又称肌纤维，常以单根、成束或成层排列[26]。新鲜鱼肉的肌纤维其扫描电镜成像排列有序，结构清晰的。

不同保水剂浸泡处理对鳜鱼肌肉组织微观结构的影响，见图3和图4。新鲜鳜鱼肌肉（图3a和图4a）内部肌肉组织排列整齐，彼此间结合紧密。蒸馏水处理组（图3b和4b），鳜鱼肌肉组织结构发生了明显变化，肌束细胞破坏严重，纹理模糊，肌束间的间隙变大，出现许多大孔洞，这可能是由于冻藏过程中形成的冰晶破坏了肌肉组织细胞，加剧了冻藏过程中蛋白质变性，导致肌束间的孔间距增大。2.5%食盐处理组（图3c和4c），鳜鱼肌肉组织间产生了许多空隙，肌束发生撕裂，肌肉细胞被破坏，孔洞面积较大。4%STPP处理组（图3d和4d），鳜鱼肌束间产生了较多空隙，然而其肌肉纤维排列仍较紧密，孔洞直径较蒸馏水处理组小。鳜鱼鱼鳔酶解液+2.5%食盐处理组（图3e和4e），盐组图谱相比，发生左移，说明添加鳜鱼鱼鳔酶解液和2.5%食盐复配处理的鳜鱼鱼肉保水性发生显著性变化，弛豫时间缩短，鱼肉肌纤维中可移动水的水分流动性减弱。进而证明，鳜鱼鱼鳔酶解液与2.5%食盐协同使用可以有效提高鳜鱼鱼肉的保水性。鳜鱼肌肉排列仍较紧密，完整性好，肌束细胞未见明显撕裂，肌束间空隙较小，与新鲜鳜鱼肌肉组织较为接近。这可能是因为鳜鱼鱼鳔酶解液中富含蛋白质酶解所产生的游离氨基酸、长链多肽、短肽等释放出较多数量可与肌肉蛋白质亲水结合的官能团如羧基、羟基等，增强其稳定性，进而提高肌肉的保水性[27]，抑制了蛋白质变性。而食盐有助于蛋白质结合成网状结构，加强保护层，可束缚更多的水分[28]。

图2 不同保水剂处理的冷冻鳜鱼的弛豫时间T2Fig.2 Relaxation time T2 of various kinds of freezing mandarin fish with different treatments

3 结论

在冻藏过程中，不添加保水剂的水产品品质下降严重，而添加传统商业保水剂如磷酸盐等，若添加过量会影响消费者健康。本研究发现，鳜鱼加工副产物的酶解产物能作为冷藏鳜鱼鱼肉的有效保水剂。鳜鱼鱼鳔酶解液+2.5%食盐浸泡处理能有效降低鳜鱼的汁液损失，在保持冷冻鳜鱼硬度、弹性和咀嚼性方面具有较好的效果，减弱了鱼肉中水分的整体流动性，微观结构显示，处理后的冷冻鳜鱼肌纤维变化较小，对冷冻损伤具有良好的保护作用。鳜鱼鱼鳔通常为加工副产物，大多被废弃，既浪费资源，还会造成环境污染。本研究利用名贵鳜鱼的加工副产物鱼鳔进行品质提升研究，取之于鱼，用之于鱼，既实现了副产物的高值利用又减轻了环境压力，为鱼鳔等副产物的再利用提供了一条有效途径，也为开发新型无磷保水剂提供了理论依据。

图3 不同保水剂处理的鳜鱼肌肉结构（纵切）Fig.3 SEM micrographs of mandarin fish（longitudinal cross sections）

图4 不同保水剂处理的鳜鱼肌肉结构（横切）Fig.4 SEM micrographs of mandarin fish（transverse cross sections）