舟山海域光参酶解嫩化工艺研究

周光东 位正鹏 霍健聪，3* 邓尚贵

（1 浙江海洋学院食品与医药学院 浙江舟山 316000

2 荣成泰祥食品股份有限公司 山东荣成 264300

3 浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室 浙江舟山 316000）

海参（Sea cucumber）为海参属（Holothuroidea），是一种生活在浅海到数千米深海的海洋棘皮动物。我国是世界上为数不多的海参消费国，食用海参已有数千年的历史。海参以其味道鲜美、营养丰富，具有保健功效而深受消费者的欢迎，被列为“海八珍”之首，成为高档海产品的典型代表。我国还是海参生产大国，主要分为两类：刺参和光参。刺参也称北参，主产于北方海域，以山东和辽宁为代表。刺参肉质肥厚、营养丰富，成为海参市场的主要产品。而近年来随着“抗生素刺参”、“糖干刺参”等食品安全事件的出现，市场对刺参的需求显著降低。开发新的海参资源，以满足市场对海参产品的旺盛需求成为当务之急。

光参（Cucumaria japonica）主产于南方各省份，有光参科、瓜参科和芋参科。光参目前全部为野生捕捞，尚无养殖光参，具有安全、天然等特点。长期以来，光参资源保有量大，其自体酶活性高，捕捞出水后需立刻进行剖杀、蒸煮、晒干等工艺处理，然而处理后的干光参体表极为坚硬，难以泡发，这一特点极大的限制了光参的市场需求，渔民捕获后通常直接丢弃，部分进入市场的光参售价也仅为20～30元/kg，造成这类资源难以得到充分利用，经济价值、营养价值和保健价值未得到充分体现。目前关于光参的研究多集中在酶解产物特性上[1-3]，关于光参嫩化的系统研究成果寥寥无几。在此背景下，本研究以舟山产光参为对象，利用复合酶对其进行生物嫩化，以降低光参硬度，提高食用品质，为舟山海域光参资源的高值化开发利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

光参，浙江海士得食品有限公司。原料捕捞于舟山鱼山渔场（28°00"-29°30"N，121°54"-125°00"E），捕捞出水后按传统加工工艺立刻剖杀、去内脏并蒸煮（100℃沸水中煮15min），蒸煮后的光参置于敷有碎冰的泡沫箱后运到实验室；原料运抵实验室后于烘箱内烘干至水分含量约23%），即得干光参。

刺参，威海红一切食品有限公司。泡发工艺：将干刺参置于自来水中浸泡3 h后换水，再浸泡6 h后换水，后每隔12 h换水浸泡，浸泡时间总计60 h，而后将海参沥干水分放入普通家庭用高压锅，高压处理15min，后将海参重新放置于纯净水中浸泡3 h后换水，而后每隔12 h换水浸泡，总计浸泡时间为72 h。刺参泡发结束后沥干，置于冷藏室保存，即为泡发刺参。同样按照刺参的泡发工艺对光参原料进行处理，即得泡发光参；原料经浙江海洋学院海科学院鉴定为海地瓜（Acaudina molpadioides，以下简称光参）和刺参（Apostichopus japonicus）。

动物蛋白水解酶（28 000 U/g，自测）、中性蛋白酶（50 000 U/g）、胰蛋白酶（4 000 U/g），南宁庞博生物工程有限公司。试验所用化学试剂均为分析纯级，国药集团上海化学试剂有限公司。

紫外分光光度计（U-2800）、高速冷冻离心机（CR21G），日本日立公司；TMS-PRO质构仪，美国FTC公司；pH 计（DECTA320A/C），瑞士梅特勒托利多公司；恒温冷冻切片机（SYD-K2040），北京爱普瑞莱医疗器械有限公司；光学显微镜（BX51），日本奥林巴斯公司；透射电镜（JEM-2100F），日本电子株式会社；其余均为试验室常用设备。

1.2 试验方法

1.2.1 光参酶解处理 通过预试验初步确定选用动物蛋白水解酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶为初选酶制剂。在3种酶最佳酶解条件下（动物蛋白水解酶为50℃，pH 7.5；中性蛋白酶50℃，pH 7.0；胰蛋白酶为37℃，pH 8.0）进行酶解处理，3种酶制剂按照1U/g光参比例进行酶解，根据不同酶制剂对光参胶原蛋白的溶解度不同，确定2种最优酶制剂；而后将2种酶制剂复配，做正交试验（表1），其中酶浓度是指按照表中总浓度和比例进行分配，并按照各自酶活折算为酶制剂质量。根据胶原蛋白溶解度确定最佳复配比例。

表1 复合酶的因素与水平Table1 Factor and level of compound enzyme

1.2.2 胶原蛋白溶解度的测定[4]称取一定量光参体壁组织（4 g），加入质量分数为25%Ringer液30mL，高速匀浆机处理10min后（10 000 r/min，捣碎时采用开机1min，关机30 s的方式处理），将匀浆液转移到离心管，90℃水浴锅中水浴1 h后将匀浆液进行离心处理（4 000 r/min，10min），后将上清液转移到消化瓶中，在沉淀中重新加入10 mL同质量分数的Ringer液，重新匀浆、离心，合并两次上清液。向两次提取后的上清液和沉淀中加入20，30mL浓度为7mol/L的硫酸，110℃条件下消化10 h，测定羟脯氨酸，其中上清液中胶原蛋白为可溶性，沉淀中为不溶性，然后折算为胶原蛋白含量[11]。胶原蛋白溶解度按照式（1）计算：

胶原蛋白溶解度（%）=可溶性胶原蛋白×100/（可溶性胶原蛋白+不溶性胶原蛋白）（1）1.2.3 质构特性分析 选用质构参数包括硬度、黏附型、弹性、咀嚼性、凝聚性和回复性等6项，质构仪测定模式为TPA模式，测定探头直径2mm，预压速度3mm/s，下压速度1mm/s，回复速度4 mm/s，压缩量40%，两次压缩之间停留时间10 s，触发力5 g。由得到的质构特性曲线可计算出光参的质构参数。硬度等参数计算参考孙彩玲等[5]和李云飞等[6]的方法。

1.2.4 光学显微镜观测[7]光学显微镜观测采用Van Gieson法。主要操作为：切片经二甲苯脱蜡后再采用梯度乙醇“下行”至水，而后分别以Weigert，Mayer，Harris苏木素染液深30min，流水冲洗使切片蓝化，再蒸馏水漂洗，吸水纸吸干；Van Gieson染液染色5min，吸水纸吸干，95%酒精（滴加数滴苦味酸水溶液）分色数秒钟，吸水纸吸干，无水乙醇脱水30 s后采用二甲苯透明，DPX胶封片。

1.2.5 透射电镜观测[8]酶解后的样品用冷冻切片机处理后切成5μm切片，用2.5%戊二醛（由25%戊二醛溶液10mL，去离子水40mL，0.2mol/L

pH值为7.2的磷酸缓冲液50mL混合成100mL配制而成）固定2 h后涂片，用pH 7.2磷酸缓冲液细心洗涤3次，再用1%四氯化锇固定1 h，磷酸缓冲液洗涤3次。以25%，50%，75%，95%乙醇按顺序各脱水1次，每次10min，最后用无水乙醇重复脱水2次，每次10min。将涂片放入临界点干燥器内进行干燥，干燥后的涂片放入高真空蒸发器中喷金镀膜后以电镜观察；同时制备未经酶解处理的光参及干刺参和泡发刺参样品。

1.2.6 主要活性成分测定 光参酶解前、后及刺参泡发前、后，多糖与皂甙含量测定采用国标法[9-10]。

2 结果与分析

2.1 光参质构特征

表2是不同原料初始质构参数。从表中可以看出，未经处理的干光参和干刺参在弹性、咀嚼性等多个质构参数上除硬度外差距不大，表明两种原料未经处理时食用品质均较低；而采用同样泡发工艺处理后，刺参各项质构参数均优于光参，其中以硬度最为典型，泡发后的刺参硬度仅为738 g，参体变软，容易咀嚼，而泡发光参硬度仍然较高，达到1 287 g，参体坚硬，牙齿难以插入到肌肉中，难以食用，必须经过处理降低硬度后才能食用。

表2 不同原料初始质构特征Table2 Original texture characters of different materials

2.2 酶制剂种类的确定

从表3可以看出，动物蛋白水解酶等3种酶制剂在其最佳酶解条件、处理相同时间后的酶解效果不同，其中胰蛋白酶酶解效果最差，且光参酶解后有腥味，硬度较大；而动物蛋白水解酶由蛋白内切酶、外切酶和风味酶等组成，可通过内切酶从中间切断蛋白质内部的肽链，外切酶从多肽链的未端切断释放出氨基酸，且其中含有的风味酶对水解的苦味与风味起优化作用；中性蛋白酶酶解效果介于两者之间，硬度较小。故确定将动物蛋白水解酶和中性蛋白酶作为复配酶制剂组分。

表3 不同酶制剂处理效果Table3 Effects of different enzymic preparations

2.3 复合蛋白酶酶解工艺研究

将动物蛋白水解酶和中性蛋白酶复配，做正交试验，试验水平表见表3。

正交试验结果见表4。由表4可以看出5个因子对光参的影响次序为：光参用量、温度、复合比、酶量、pH值。综合分析得出复合酶对光参最佳水解条件为：光参用量4 g/100mL，温度40℃，复合比 1∶1，酶量 6×103IU/100mL，pH 7。按照该工艺进行验证，胶原蛋白溶解度为62.4%，表明酶解效果最好，且酶解后的光参表皮并无显著破损，表观软硬适中。同单酶法相比，复配酶制剂最大特点是降低了酶制剂用量，生产成本大大降低。

在复合酶最佳酶解条件下，分别选择复合酶处理时间为15，30，45，60min，结果见表5。

表4 正交试验结果与极差分析Table4 Results of orthogonal test and range analysis

表5 不同酶处理时间光参的质构特征Table5 Texture characters of different processing time

不同时间酶解处理后光参的质构特征结果见表5。从表中可以看出，硬度和咀嚼性变化趋势相同，均随酶解时间的延长而降低，表明光参表皮胶原蛋白在复合酶作用下逐渐降解，食用品质逐渐提高；光参的凝聚性和回复性在酶解过程中变化较小，而黏附性随酶解时间的延长逐渐升高，这是由于酶解时，胶原蛋白降解后的小分子氨基酸、多肽等物质的亲水性较强，造成光参表皮黏附性升高；而光参弹性也随酶解时间的延长而逐步升高，这主要是由于光参硬度降低，且胶原蛋白经复合酶处理后发生部分降解，亲水性增强。此外，从表中还可以看出，鲜光参和泡发刺参在硬度等质构指标上较为接近，而酶解45min时，酶解光参的质构参数同鲜光参和泡发刺参接近。因此，确定复合酶酶解时间为45min。

图1 复合酶处理后光参Fig.1 The Acaudina molpadioides after treatment with compound enzyme

2.4 光参复合酶酶解效果观测

按照复合酶酶解工艺参数（光参用量4 g/100 mL，温度40℃，复合比1∶1，酶量6×103IU/100 mL，pH 7，时间 1 h）处理光参，并采用 Van Gieson法染色后，胶原纤维被染成红色，而肌肉纤维被染成黄白色，采用光学显微镜拍摄，如图2所示。从图中可以看出，不同样品经染色处理后都出现网状结构，这些网状结构均为胶原蛋白网络，而图2a中网络密度最高，图2c和图2d中网络密度较小，这表明染色后样品的网络密度可以在一定程度上反映其食用品质。其中，鲜光参网状结构密度显著低于干光参，而同泡发刺参密度相近，这表明在新鲜状态时，光参食用品质较高，而经煮制熟化后的光参网格密度显著升高，则其硬度上升，食用品质下降；此外，从图中还可以看出，经过酶解处理后的光参体壁再经染色后，发现红色区域已经大幅缩减，基本上无成型的网状结构出现，表明体壁胶原蛋白已经发生降解；此外，从图中还可以看出，经酶解处理后的光参网格密度最低，表明其硬度最小，这也印证了表5的结果。

图2 酶解前、后光参体壁结构变化Fig.2 Changes in the structure of the body wall before and after enzymatic hydrolysis

2.5 复合酶酶解电镜照片观测

按照复合酶酶解软化工艺条件对光参进行酶解处理后采用透射电镜得到图3。图3a～d分别为干光参、酶解光参、干刺参和泡发刺参透射电镜图。从图3a、3c可以看出，干光参和干刺参色泽较深，质地致密，纤维空隙小、紧密，表观对应其硬度较高；而从图3b、3d中可以看出，无论是经过酶解处理的光参还是经过泡发的刺参，其色泽明显变浅，质地由紧密变松散，尤其是干光参中粗大的纤维经酶解后基本消减，酶解光参和泡发刺参参体也由坚硬变为柔软，硬度显著降低。由此可见，采用动物蛋白水解酶和中性蛋白酶的混合处理可显著降低光参硬度，实现软化光参的目标。

图3 光参酶解前、后透射电镜图Fig.3 Transmission electron microscopy before and after enzymatic hydrolysis

2.6 酶解处理前、后光参主要活性成分变化

表6表示酶解前、后光参多糖和皂甙的变化。从表中可以看出，刺参在泡发处理后两种主要活性成分含量均有所降低，而降低幅度不大；光参酶解处理后多糖含量基本不变（降低0.04%），而皂甙含量反而上升一倍，达到688mg/100 g，这表明酶解软化处理不仅对光参主要生理活性成分含量没有任何影响，反而具有促进生理活性物质含量提高的效应，对于光参的生物酶解软化处理具有重要意义。

表6 酶解处理前、后光参及刺参主要活性成分比较Table6 Comparison of the main active components of Acaudina molpadioides and Apostichopus japonicus before and after enzymatic hydrolysis treatment

3 结论

1）酶制剂种类繁多，不同酶制剂对蛋白多肽链作用位点不同。本研究选用海产品中应用较多的3种酶制剂，即动物蛋白水解酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶作为初始酶制剂。通过试验发现，动物蛋白水解酶酶解效果最好，中性蛋白酶酶解处理后光参腥味较轻，口感较好，因而选择动物蛋白水解酶和中性蛋白酶为酶解用酶。

2）以胶原蛋白溶解度为测试指标，通过质构参数分析确定动物蛋白水解酶和中性蛋白酶的复合最佳酶解工艺参数为光参用量4 g/100mL，温度40℃，复合比 1∶1，酶量 6×103IU/100mL，pH 7，时间1 h。

3）透射电镜结果显示酶解前、后光参表皮蛋白肌纤维结构有较大变化，肌纤维由致密变疏松，达到了酶解软化的目标。

4）生物酶解软化处理后光参皂甙含量显著提高，多糖含量略有降低。