食用玫瑰花水提物对大鼠肠道微生物和基因表达的影响

周小飞 熊文艳 吴恩凯 张 欢 张婷婷 彭春秀*

（1 云南农业大学食品科学技术学院 昆明 650201

2 云南农业大学园林园艺学院 昆明 650201）

玫瑰花（Rosa rugosa）为蔷薇科蔷薇属落叶直立灌木，作为中国传统中药的一种，具有促进血液循环、疏肝解郁、减轻乳房疾病的作用[1]；对于软化心脑血管、缓解高血压及消除妇科炎症有显著疗效[2]。玫瑰花成分复杂，含有黄酮类、多酚类等多种化学成分[3]，是药食两用的新食品资源。在保加利亚，玫瑰花被用于治疗胃肠道疾病；在俄罗斯，玫瑰花更被推荐用于治疗肺部疾病和上呼吸道感染[4]。不仅如此，在中国传统中药学中玫瑰花被称为君子药，具有性温和、香气甜润、排毒养颜、行气活血、开窍化瘀、疏肝醒脾、促进胆汁分泌、帮助消化、调节机理之功效[5]。现代科学研究也证明，玫瑰花抗氧化、抗衰老、降血糖，能够平衡及强化胃肠道功能等，对情绪紧张、压抑等引起的胃痛有明显的改善功能。

人体中细菌的数量与人类细胞的数量是相同的[6]。许多研究认为，肠道微生物对活性成分功能的发挥有重要作用[7]，并且肠道菌群对人体健康有重要影响。肠道菌群与代谢疾病、免疫类疾病、胃肠道类疾病甚至精神类疾病相关联。结构失调的菌群可能是诱发慢性病的重要因素。有数据显示，因肠道菌群失调而导致临床患病的概率为2%～3%。Zackular等[8]提出影响肠道菌群的因素有很多，而最主要的影响因素是饮食。现代研究表明，食物对大脑健康的影响并不是因为食物必定导致机体的炎症反应，而是始于食物对于肠道微生物平衡的破坏。饮食结构与人体肠道菌群之间存在一定的互动关系并影响着人体健康。

玫瑰花有许多功能，课题组提出玫瑰花的功能很可能与肠道微生物有密切关系，玫瑰花可能会改变或影响肠道微生物，在两者的相互作用下发挥相应的功效。本文主要通过浸提食用玫瑰花水提取物，以SD（Sprague Dawley）大鼠为实验动物，灌胃不同剂量的提取物，利用高通量测序技术（16S rDNA V3+V4区测序）分析大鼠粪便和盲肠内容物的微生物多样性和丰度，明确食用玫瑰花对大鼠肠道微生物的影响程度，并结合转录组测序结果从肠道微生物的角度揭示玫瑰花对机体的功能作用。

1 材料与方法

1.1 材料

玫瑰花（云南墨红品种），大理七彩云花生物有限公司。

1.2 主要试剂

无水乙醇、无水乙醚，天津市化学试剂三厂；甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，烟台奥斯邦生物工程有限公司；Trizol，美国Invitrogen公司。

1.3 主要仪器

电子天平（感量为0.0001 g），沈阳龙腾电子有限公司；数显恒温水浴锅（HH-8）：国华电器有限公司；真空冷冻干燥机（BILON-12）；郑州比朗仪器有限公司；高速多功能粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司；海尔冰箱（BCD-208K/A）。

1.4 试验方法

1.4.1 玫瑰浸提物的提取流程[9-11]新鲜玫瑰花瓣→初步晒干→烘干→粉碎→粉末→35倍蒸馏水浸提3次→过滤→合并滤液→真空冷冻干燥→冻干物粉碎→玫瑰水提物。

1.4.2 实验动物的分组与饲喂管理

1.4.2.1 实验动物的选择[12]实验动物由昆明医科大学提供[实验动物许可证：SYXK（滇）K2015-0002]，选择健康成年雄性SD大鼠，体重130～150 g，发育正常，无畸形，无外伤及皮肤污染物；体形丰满，头部端正，胸廓和背部良好及宽阔，臀部浑圆而匀称，四肢正常；眼部无分泌物，鼻无黏液流出，口腔无出血，耳无外伤；营养良好，饮食和两便正常，行动迅速，反应灵敏。

1.4.2.2 饲养方法及管理 在空调动物饲养室中同室群笼饲养大鼠，自由采食和饮水。每天换一次垫料、鼠笼，清洗饮水瓶。每天定时通风，记录动物室温度和湿度，要求室温（20±2）℃，湿度45%～60%。基础饲料配方：玉米350 g/kg、麦麸250 g/kg、豆粨 250 g/kg、鱼粉 80 g/kg、酵母 20 g/kg、骨粉 20 g/kg、乳清粉 10 g/kg、盐 5 g/kg、菜油 5 g/kg、矿物添加剂1 g/kg、复合维生素0.3 g/kg、蛋氨酸1.3 g/kg、赖氨酸0.7 g/kg、鱼肝油0.5 g/kg，由昆明医学院实验动物中心制作。

1.4.2.3 实验动物组别设计所有大鼠全部饲喂基础饲料一周以适应环境和饲喂方式。1周后根据TC基础值水平，随机分为4组，每组8只大鼠。适应期结束后进入为期28 d的干预期，其中对照组灌胃蒸馏水，玫瑰组按照试验设计剂量每日经口灌胃玫瑰水提物。具体设计见表1。

表1 实验动物组别设计Table1 Group design of experimental rats

1.4.2.4 灌胃剂量 龙刚[13]研究表明，食用玫瑰水提物为急性无毒，LD50＞10 g/kg bw，这与普洱茶茶褐素毒性一样（龚加顺，2007）。因此，本实验参照课题组先前大鼠实验所用普洱茶茶褐素的低剂量（0.28125 g/kg bw）、中剂量（0.5625 g/kg bw）、高剂量（1.125 g/kg bw）作为本次试验剂量。

1.4.3 待测血清、盲肠内容物、粪便及肝脏组织的制备[14]

1.4.3.1 血清制备 适应期7 d和干预期28 d结束时，12 h禁食不禁水，乙醚麻醉大鼠，眼眶采血。收集血样室温放置1 h后，3 000 r/min低速离心15min后，用移液枪吸取上层血清分装于离心管中，待测。

1.4.3.2 粪便采集 干预期28 d结束时，无菌条件下收集大鼠24 h内的粪便，分别命名为正常对照组（CZC）、玫瑰水提物低剂量组（CDL）、玫瑰水提物中剂量组（CZL）、玫瑰水提物高剂量组（CGL），分别置于-80℃冰箱保存备用。

1.4.3.3 盲肠内容物的采集及肝脏的摘取 干预期28 d结束后，乙醚麻醉大鼠，由试验人员按住大鼠的颈部，于无菌的条件下，用手术刀划开大鼠腹部，取出盲肠内容物，置于无菌试管内，分别命名为正常对照组（BZC）、玫瑰水提物低剂量组（BDL）、玫瑰水提物中剂量组（BZL）、玫瑰水提物高剂量组（BGL）；摘取肝脏，置于无菌试管内，分别命名为正常对照组（AZC）、玫瑰水提物低剂量组（ADL）、玫瑰水提物中剂量组（AZL）、玫瑰水提物高剂量组（AGL）。

1.4.4 指标测定

1.4.4.1 生长指标的测定 每日观察大鼠的活动情况，记录饮水量和采食量，每周测量体长，称量体重。

1.4.4.2 血清生化指标的测定 采用Au680全自动生化仪进行高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、总胆固醇含量的测定。

1.4.4.3 大鼠盲肠内容物和粪便的测定[15]采用16S rDNA测序技术，对样品V3+V4可变区的PCR产物进行测序，拼接成Tag，并根据Tag进行物种分类、OTU分析、多样性分析、多样品的比较分析等。

1.4.4.4 大鼠肝脏组织RNA的提取 采用TRIzol法并对Total RNA质量进行检测。

1.4.4.5 各组样品cDNA文库的构建和Illumina HiSeqTM2500测序；由广州基迪奥公司完成。

1.4.5 统计分析 数据以“平均值±标准差”表示，所有数据先进行Grubbs检验，以排除过失误差；经G检验合格的数据，采用SPSS19.0，用邓肯氏法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 玫瑰水提物对大鼠生长发育及脂质含量的影响

各组大鼠体重、采食量、饮水量均无显著性差异；各组大鼠TC、TG、LDL和HDL值均无显著性差异，说明低、中、高剂量玫瑰水提物对大鼠的生长和各项指标均不产生异常影响。

2.2 玫瑰水提物对大鼠肠道菌群的影响

Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析，包括chao1值、ACE值、香农以及辛普森指数[16]等。香农指数越大，辛普森指数越接近于0，就表示该样品中的物种越丰富。表2根据辛普森指数的大小，粪便样品中各组别物种丰富程度为CGL＞CZC＞CZL＞CDL，说明高剂量玫瑰水提取物提高了大鼠粪便微生物的多样性。盲肠内容物样品中各组别物种丰富程度为BGL＞BZC＞BZL＞BDL，这也说明高剂量玫瑰水提物有助于改善大鼠盲肠微生物的多样性。

表2 样品在0.03距离下的Alpha丰富程度Table2 Samples at distances of 0.03 Alpha richness

通过不同组别样品最佳分类水平上的物种分布图1的结果发现，不同饮食的大鼠盲肠微生物含量有明显差异。从图1e～图1h可以看出，每组均含有普氏菌属和拟杆菌属，以及密螺旋体属和颤螺旋菌属，普氏菌属的含量为BGL＜CZC＜CZL＜CDL；拟杆菌属的含量为BDL＜BGL＜BZL＜BZC；颤螺旋菌属的含量为BDL＜BZL＜BZC＜BGL；密螺旋体属的含量为BZL＜BDL＜BZC＜BGL。说明高剂量玫瑰水提取物有助于增加大鼠盲肠密螺旋体属和颤螺旋菌属含量。安锋利[17]发现在以蛋白质、脂肪为主要膳食成分的人群中，拟杆菌属为肠道菌的主导者；当机体长期大量摄取糖类时，普氏菌属则成为主导菌群。本实验结果中，普氏菌属在每组大鼠盲肠微生物中均为优势菌群。2015年，Scheperjans等[18]首次报道了帕金森病患者肠道微生物组成的变化。该研究发现与正常人相比，帕金森病患者肠道中普雷沃菌科减少。而本实验结果发现，低中剂量玫瑰水提物均对大鼠普雷沃菌科有增加趋势，因此，推测低中剂量玫瑰水提物对预防帕金森病有一定效果。

从图1a～图1d可以看出不同饮食（正常对照组、玫瑰水提物低剂量组、玫瑰水提物中剂量组、玫瑰水提物高剂量组）的大鼠粪便中普雷沃氏菌科和拟杆菌科含量差异明显。普雷沃氏菌科的含量为CGL＜CZC＜CZL＜CDL；拟杆菌科的含量为CDL＜CZC＜CGL＜CZL；S24-7的含量为CZL＜CDL＜CGL＜CZC；毛螺旋菌科的含量为CGL＜CDL＜CZC＜CZL；瘤胃菌科的含量为CZC＜CGL＜CDL＜CZL。这里普雷沃式菌科与盲肠内容物样品中普氏菌属一样，属优势菌，然而，高剂量玫瑰水提取物可抑制普雷沃氏菌科的含量，增加拟杆菌科的含量。Ley等[19]研究发现肥胖鼠盲肠内容物或肥胖人粪便的拟杆菌门数量低于瘦鼠或瘦人，即拟杆菌增加有助于控制体重，说明高剂量玫瑰水提取物具有潜在的减肥功能，这可能与高剂量玫瑰水提取物增加了大鼠肠道微生物多样性密切相关（见表2）。

图1 最佳分类水平上的物种分布图Fig.1 Species distribution on the best classification level

2.3 不同组别大鼠肝脏组织转录组测序

2.3.1 总RNA、测序文库质检结果所建文库经检测，正常对照组文库质量浓度为1 230 ng/μL；玫瑰水提物低剂量组文库质量浓度为1 296 ng/μL；中剂量组为1 299 ng/μL；高剂量组为1 188 ng/μL。Agilent 2100检测显示4个样品RNA分子完整数均为8.6，表明RNA质量完好，满足后续的测序和分析要求。

2.3.2 基因的表达量统计及差异表达基因筛选本文采用FPKM（Fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）值来计算基因表达量。通过分析4个样本的基因表达量，共有22 460个基因存在差异表达，有152个基因上调表达，171个下调表达。各组大鼠差异基因散点图如图2所示。与正常对照组相比，玫瑰水提物低剂量组显著差异表达的基因有101个，上调52个，下调49个；中剂量组有101个，上调56个，下调45个；高剂量组有76个，上调37个，下调39个；与低剂量组相比，玫瑰水提物中剂量组显著差异表达的基因有76个，上调47个，下调49个；高剂量组有101个，上调63个，下调72个；与中剂量组相比，玫瑰水提物高剂量组显著差异表达的基因有80个，上调42个，下调38个。根据基因的显著差异表达，推测大鼠在饮用玫瑰水提物一个月后，由于生物的适应性和应激响应而出现了新的转录本。

图2 差异基因散点图Fig.2 Differential gene scatter plot

2.3.3 显著富集通路分析 显著富集通路分析能准确的将基因定位在某个代谢途径中的某一个节点上，并确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。肝脏差异表达基因筛选与分析如表3所示。

由表3可知，通路中可注释的所有基因有7 136个，与对照组相比，低剂量组通路能够注释的显著差异基因有24个；中剂量组有30个；高剂量组有22个。与对照组相比，低剂量组显著富集的通路为抗原加工和提呈（ko04612）；中剂量组显著富集的通路有4条，分别是抗原加工和提呈（ko04612）、TNF信号通路（ko04668）、NOD样受体信号通路（ko04621）、破骨细胞分化（ko04380）；高剂量组显著富集的通路有6条，分别为抗原加工和提呈（ko04612）、MAPK信号通路（ko04010）、细胞黏附分子（ko04514）、吞噬体（ko04145）、T细胞受体信号通路（ko04660）和TNF信号受体通路（ko04668）。与低剂量组相比，中剂量组通路可注释的显著差异基因有28个，显著富集的通路主要有抗原加工和提呈（ko04612）、TNF信号通路（ko04668）、破骨细胞分化（ko04380）、NOD样受体信号通路（ko04621）和吞噬体（ko04145）。以上显著富集通路主要集中在免疫系统和信号转导运输相关的通路中。

表3 显著富集通路Table3 Pathway of significant enrichment

表3的结果说明玫瑰水提物对大鼠抗原加工和提呈通路有显著影响。抗原加工和提呈是指抗原提呈细胞（Antigen presenting cells，APC）摄取抗原并加工成肽分子，以主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）-肽分子复合体表达于细胞表面，由T细胞上T细胞受体特异性识别抗原肽-MHC复合物后启动细胞内信号传递系统，进而诱导淋巴细胞活化、增生、分化，从而产生一系列免疫学效应。抗原提呈过程在免疫应答过程中起中枢作用[20]。APC在机体的抗肿瘤免疫功能中起着非常重要的作用。APC摄取和加工抗原，以MHC_I类分子或MHC_Ⅱ类分子将抗原信息分别提呈给CD8+T细胞或CD4+T细胞，激发特异性免疫反应。

2.3.4 显著差异基因分析 根据基因注释，对主要差异基因进行分类统计，结果如表4所示。

表4中各组log2比值的绝对值大于1的为两组的显著差异表达基因。其中，差异基因的log2 Ratio的绝对值大于9的有RT1-DMa，Hspa1b，LOC100910771和Pak2。

图3 抗原加工与提呈通路图Fig.3 Pathway of antigen processing and presentation

表4 主要显著差异表达基因Table4 Significant different expressed gene

Hspa1b基因表达产生HSP（Heat shock protein）蛋白[21]，属热休克蛋白基因家族，是在从细菌到哺乳动物中广泛存在的一类热应急蛋白，是一种保护性蛋白，其产物参与炎症和应激反应，并作为分子伴侣在内源性抗原的加工提呈中发挥作用，用于细胞救急，高温引起HSP，之后被切割的抗原进入细胞。当细胞受到很大环境压力时，它的第一反应就是合成更多的热休克蛋白。玫瑰水提物低剂量组相比正常对照组，Hspa1a（+1.6）表达显著上调，Hspa1b（-2.1）和LOC103692716（-1.2）表达显著下调。玫瑰水提物中剂量组与正常对照组相比，Hspa1b（-2.0）和LOC103692716（-2.3）基因表达均显著下调。而玫瑰水提物高剂量组与正常对照组比，Hspa1b（-10.4）显著下调，LOC103692716（-0.6）基因表达下调。

RT1-Dma也称为MHC II，属于ko4612通路。MHC分子在免疫应答过程中参与抗原识别。在MHCⅡ通路途径中RT1-DMa（-11.9）基因表达显著下调。因此，CD4可识别或结合细胞表面的MHCⅡ类分子减少，则CD4T细胞上的T细胞受体信号转导减少。

表4结果显示，灌胃中剂量玫瑰水提物的大鼠与灌胃蒸馏水大鼠相比较，特异性杀伤靶细胞的能力增强，免疫能力提高。在整个MHCⅠ和MHCⅡ通路中，MHCⅠ中 RT1-A1（+2.1）、RT1-CE16（+1.6）、RT1-CE10（+1.4）基因表达均显著上调。因此，CD8可识别或结合细胞表面的MHCⅠ类分子增多，则CD8T细胞活化增强，亦使分化出的细胞毒性T细胞（CTL）增多，CTL具有细胞毒作用，最终特异性杀伤靶细胞（细胞内寄生病原体感染的细胞或肿瘤细胞）的能力也增强。

MAP3K7（TAK1）属于通路 ko44027。丝裂原活化蛋白激酶[22]（Mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究表明，MAPKs信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性，在低等原核细胞和高等哺乳类细胞内，目前均已发现存在着多条并行的MAPKs信号通路，不同的细胞外刺激可使用不同的MAPKs信号通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应（如细胞增殖、分化、转化及凋亡等）[23-24]。相对于正常对照组，玫瑰水提物低剂量组的MAPK基因表达上调（+0.5），而中剂量组（-1.1）和高剂量组（-1.3）MAPK基因表达均显著下调。

PAK1属于通路ko4409。p21活化激酶（p21-activated kinases，PAKs）属于进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族[25]。它们在信号通路中主要以结节（nodal）激酶的角色连接上下游靶蛋白，是重要的肌动蛋白细胞骨架重构和细胞迁移的调节分子[26]。相对于正常对照组，玫瑰水提物高剂量组的PAK1（+9.8）基因表达显著上调。表明高剂量玫瑰水提物可能促进正常大鼠肌动蛋白细胞骨架重构和细胞迁移。

生长阻滞和DNA损伤诱导基因（Growth arrest and DNA damage 45G，GADD45G） 也称作CR6、DDIT2和GRP17，是GADD45家族的重要成员，该基因家族是对细胞增殖进行负性调控的应激反应基因家族。GADD45G可参与DNA损伤修复[27]，在细胞凋亡、细胞生存以及信号转导等方面发挥重要作用，与肿瘤发生、发展和转归的关系亦十分密切。近年来大量的研究证实，GADD45G在淋巴瘤、肺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、骨髓癌、甲状腺癌以及垂体腺瘤等广泛的癌症中表达下调。表4显示，随着玫瑰水提取物浓度的增加，与正常对照组相比，GADD45G表达逐渐增强，中剂量（+1.9）和高剂量组（+2.2）GADD45G表达均显著上调。显示出玫瑰水提取物对可能具有潜在的诱导肿瘤细胞衰老的作用。

白伟芳[28]研究表明玫瑰花多糖具有一定的抗肿瘤活性，它能提高机体免疫力和抗氧化能力从而达到抑瘤的作用。因此，玫瑰水提物的作用是否与所含多糖有关，需要进一步研究。同时，饮用玫瑰水提物后，大鼠肝脏中的一些免疫相关基因如HSPA1_8，MHC1，MHC2，MAP3K7，TAK1和PAK1等转录活动发生显著变化；环境信息处理中的信号通路如CAMs、TNF信号通路和MAPK信号通路被激活；一些分子过程的通路如吞噬体也被激活。这对于揭示玫瑰花的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老等作用提供新思路。这些作用的发生得益于玫瑰水提取物具有改善肠道微生物的多样性，特别是高剂量玫瑰水提取物。今后需进一步研究玫瑰水提取物在机体内的代谢组学，深入揭示提取物-肠道微生物-机体健康关系。

3 结论

低、中、高剂量玫瑰水提物均对正常大鼠血脂指标和生长发育指标无显著影响。低剂量玫瑰水提取物有助于提高粪便和盲肠中普雷沃氏菌科含量，降低拟杆菌科含量。而高剂量玫瑰水提取物可有效改善大鼠粪便和盲肠微生物的多样性。同时，降低粪便和盲肠中普雷沃氏菌科含量，提高拟杆菌科含量。表明玫瑰水提取物剂量不同对肠道微生物的影响差异极大。肝脏转录组学结果显示，不同剂量的玫瑰水提取物均显著影响抗原加工和提呈（ko04612）通路，剂量越高受影响通路越多。这与高剂量玫瑰水提取物对肠道微生物有较大影响有关。推测玫瑰水提取物可通过干预肠道微生物多样性，进而影响机体健康。肝脏转录组学结果也提示玫瑰水提取物可能具有潜在的诱导肿瘤细胞衰老，提高机体免疫功能的作用。