外周血cfDNA及其在临床转化中的方法学研究进展
2020-01-16刘杰刘冬郭鹏北华大学吉林吉林303北华大学附属医院肾病风湿病科
刘杰 刘冬 郭鹏 (北华大学,吉林 吉林 303;北华大学附属医院肾病风湿病科)
外周血循环游离DNA(cfDNA)的检测作为一种无创、低耗、高效的液体活检手段,凭借其得天独厚的优势,将逐渐成为未来精准医学、个体化医疗发展过程中不可或缺的组成部分。近年来,随着分子生物学检测技术的日新月异,关于肿瘤患者cfDNA检测的临床研究逐渐增多,并已获得了许多令人欣喜的成果。但介于研究中不同的标本采集、预处理、储存方式及多样化的检测方法,不同的研究所得检测结果往往差异显著。因此,这种液体活检手段迟迟未能应用于临床。未来,建立一套从标本采集到cfDNA分离、检测等一系列可用于临床推广的标准化检测流程将成为该领域转化医学研究的核心内容。本文将对cfDNA的来源机制及目前各类临床研究中外周血cfDNA的分离和检测方法作一综述。
1 外周血cfDNA
外周血cfDNA是一种无细胞状态的胞外DNA,1948年Mandel〔1〕首次在健康人外周血中发现了这种游离DNA的存在。1977年Leon等〔2〕进一步发现肿瘤患者cfDNA水平明显高于健康人群。10年后,Stroun等〔3,4〕进一步发现某些肿瘤源性的cfDNA具有与原发肿瘤高度相似的遗传变异。1994年Vasioukhin等〔5,6〕进一步证实了上述说法,分别在急性髓系白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征及胰腺癌患者的外周血游离DNA中检测到与上述原发疾病相同的RAS基因突变。近20年来,已经有越来越多的研究〔7~12〕证实了癌症患者外周血cfDNA与肿瘤组织遗传变异的高度一致性,这些遗传变异包括癌基因、抑癌基因的突变〔11〕,微卫星不稳定性〔13〕及DNA甲基化〔14〕等等。由此,外周血cfDNA的检测作为一种新型“液体活检”手段已成为近年来肿瘤转化医学中的研究热点〔15,16〕。
2 外周血cfDNA机制
2.1外周血cfDNA来源 目前为止,鲜有研究数据可以直接诠释DNA被释放入血的具体过程及途径。公认的外周血cfDNA来源的主要途径为细胞的凋亡与坏死。
2.1.1健康人群外周血cfDNA来源 正常健康人体内由于存在自身的平衡机制使其血中游离DNA维持在一个较低水平,一般波动于0~100 ng/ml之间,均值30 ng/ml左右。这些微量目的DNA片段几乎均来自于凋亡或坏死的细胞,包括细胞核及线粒体DNA的释放,而与细胞核DNA相比,线粒体DNA可能对氧化损伤更为敏感〔17〕。此外,也有研究〔18〕称健康人体内所有的活细胞都自发性向血液中释放DNA片段,并称其为代谢性DNA片段。
2.1.2肿瘤患者外周血cfDNA来源 与健康人群相比,肿瘤患者外周血cfDNA水平明显增高。那么为何肿瘤患者外周血cfDNA水平与健康人群存在如此巨大的差异呢?有文献〔19〕称肿瘤患者增加的游离DNA可能同时来自于肿瘤细胞及其邻近的非肿瘤细胞,且随着肿瘤体积的增加,肿瘤患者体内凋亡及坏死细胞数目也随之增长,这些过度凋亡及坏死的细胞超出了巨噬细胞的清除能力,进而不可避免的导致大量细胞碎片释放入血。结合目前的研究〔20〕来看,肿瘤患者外周血cfDNA的来源机制较为复杂,且结论尚不一致,有如下几种观点。首先,与健康人群类似,细胞凋亡仍被公认是肿瘤患者DNA释放入血的主要驱动因素之一〔21,22〕,凋亡细胞经巨噬细胞吞噬后,其内DNA可释放入血成为cfDNA中的一员。有研究〔23〕对血浆标本进行的可视化凝胶电泳中,发现外周血中cfDNA片段的大小呈阶梯样均匀分布在180~1 000 bp,这与凋亡细胞的电泳条带高度类似。其次,也有研究〔24〕发现细胞凋亡后在原位就会被巨噬细胞迅速吞噬,而并不会引起游离DNA水平的明显变化,因此推测肿瘤细胞的坏死可能是外周血游离DNA的主要来源。但是,此种观点目前存在的争议较大,早前的体外实验中,研究者们发现巨噬细胞在吞噬坏死肿瘤细胞过程中可被激活或死亡,这将导致细胞的核酸片段被释放入血。而后,Cheng等〔25〕又动态监测了恶性肿瘤放疗患者外周血cfDNA水平,发现放疗后的2 w内患者cfDNA水平明显上升,之后又迅速降低,这也力证了上述观点。Sikora等〔26〕的研究指出,在胰腺导管腺癌、胰腺内分泌肿瘤及慢性胰腺炎的患者血浆中也几乎均检测不到可能来源于坏死细胞的更大片段的cfDNA。
3 外周血cfDNA的提取及提取前准备
3.1外周血cfDNA提取前血样标本的采集、预处理与储存 外周血cfDNA检测手段迟迟未能于临床推广的最主要原因之一就是目前多数研究所得的检测结果均存在差异,而这种差异常常被认为来源于不同的患者因素或检测手段的灵敏性,却很少有人注意到样本采集、预处理及外周血DNA提取前样本的储存条件等因素对待检血样中cfDNA水平及片段大小等造成的巨大影响〔27,28〕。因此,建立一套DNA提取前血样采集、预处理及储存条件等标准化的前检测程序是目前cfDNA检测临床转化研究中亟待解决的问题之一。
3.1.1血样标本的采集 关于cfDNA检测中血样标本的选择,目前的研究结论较为一致。早期已经有大量研究〔28~30〕对血浆及血清中cfDNA的水平进行了比较,并且发现血清中cfDNA水平远高于血浆,约为血浆的3~24倍。然而,研究〔28,30〕发现血清中cfDNA水平的增高是由于血液凝集过程中血细胞破裂后其内核酸物质释放入血所致,这与患者血中实际的cfDNA水平并不相符。因此,毫无疑问血浆是目前所公认的外周血cfDNA的最优检测标本。
3.1.2血样标本储存条件
3.1.2.1预处理前 血样标本采集后的储存时间及温度是目前被认为与cfDNA水平变化密切相关的两个控制因素。早期的多数研究〔28,31~33〕就已经发现随着预处理前标本储存时间的延长,其内cfDNA水平会随之增高,但储存温度则对其影响甚微。有文献〔27〕称血样标本在离心预处理前于室温或4℃条件下储存,6 h内其cfDNA水平不会产生明显变化。但多数文献〔28,31~39〕对血样标本中cfDNA水平开始变化的时限说法不一。
那么,血样标本中cfDNA水平变化的原因何在呢?首先,随着储存时间的延长,采血管中坏死和凋亡的血细胞数目逐渐增加,其破裂后将核酸物质释放入血。其次,有文献〔35〕称血样采集过程中对采血管的过度摇匀可使标本溶血,从而导致其内血细胞破坏,促使核酸物质被释放。此外,还有研究〔40〕认为部分cfDNA可结合于细胞表面,随着储存时间的延长,这部分cfDNA逐渐与细胞分离进而导致cfDNA水平的变化。因此,外周血cfDNA的检测标本在采集过程中应避免过度摇晃采血管而造成标本溶血,采集后的标本应尽早进行离心预处理以降低其被基因组DNA污染的可能性。而目前文献关于上述因素对cfDNA片段完整性影响的报道甚少,仅个别研究〔27〕认为长时间储存及血样采集过程中对标本的过度摇晃可导致cfDNA片段完整性的降低。
3.1.2.2预处理后 首先,与离心前的血样标本类似,标本的储存时间及温度仍是影响cfDNA水平的两个重要因素,但目前有关此方面的文献及研究较少,结论较为多样化。Chan等〔28〕的研究中提到离心后的血浆标本在-80℃条件下储存2 w,其内cfDNA水平无明显变化。而Holdenrieder等〔41〕对离心后血清标本中cfDNA水平的变化进行了分析,发现在4℃或25℃条件下血清标本可稳定保存144 h,但于37℃下保存6 h后,其内cfDNA水平即出现了显著下降。尽管该研究中应用了并不具代表性及说服力的血清标本,但至少可以证明离心后血样标本中cfDNA对37℃更为敏感。其后也有文献〔27〕称离心后血浆标本在室温下保存0~4 h,其内cfDNA水平会轻度增高,但这一现象可能与外周血中以其他方式(如:外泌体,微泡及核酸蛋白复合体等)存在的cfDNA被释放入血有关。而通过对比分别储存在-80℃,-20℃,4℃及室温条件下3 h的离心后血浆样本,研究者们还发现与其他3种储存温度相比,室温可能会造成血样标本中部分cfDNA的流失。其次,反复冻融则可能会导致cfDNA完整性的降低。有研究〔28〕称血样标本在反复冻融3次以上即可导致cfDNA的片段化,这一现象同时说明了cfDNA对温度变化极为敏感。随后El Messaoudi等〔27〕证实了上述说法,并建议如果不能及时对离心后的血浆标本进行cfDNA的抽提,则可将标本保存至-20℃或-80℃;如果可以即刻进行cfDNA的提取,标本可保存于4℃,但至多不要超过3 h;而冻融次数则最多不超过3次。此外,关于离心后样本长期储存对血样中cfDNA水平的影响各研究结论不一,Sozzi等〔42〕称在-80℃或-20℃条件下储存的血样,其cfDNA的损耗每年可达总量的30%。随着标本储存时间的延长,其内cfDNA每月可降低0.66 GE/ml。而2013年的一篇文献〔27〕中则提到,血浆标本在-80℃下储存,其内cfDNA水平至少可在9个月内保持稳定。然而,值得注意的是,尽管标本的长期储存对cfDNA水平影响巨大,但只要检测手段的灵敏度足够高,其水平变化将不会影响检测结果。最近,Page等〔39〕就在长达12年储存于-80℃条件下的血浆标本中分离出cfDNA并成功地进行了单核苷酸多态性(SNP)检测。
3.1.3血样标本预处理 血浆标本的离心是血样标本预处理的关键步骤,反复离心可除去血样中残存的白细胞及其破裂而释放的DNA,从而获得血中较为真实的cfDNA水平,这种反复离心不仅可在初次处理标本时连续进行,对于已经离心并冻存于-20℃的血样仍可进行二次离心处理。然而,高速离心毫无疑问将导致血细胞的大量破坏,那么这些破裂血细胞所释放的DNA是否会影响cfDNA的水平呢?目前有研究〔39〕对比了经不同速度及次数离心后血样中的cfDNA水平,发现这二者间并无显著差异,而其具体机制目前尚无人阐明。
4 外周血cfDNA的提取
传统组织DNA常用的提取方法包括酚氯仿法、硅胶柱离心法及磁珠法等等。虽然,这些方法既往在组织DNA提取的相关研究中表现出色,但由于受到有害试剂、操作不便及对于DNA片段大小的特殊要求等因素的制约,导致了它们在血浆cfDNA提取过程中较高的相对丢失率、抑制率和较低的相对提取率。而有研究〔43〕称,能够影响外周血cfDNA提取物产量的独立因素包括提取方法、定量检测中靶基因的设定及实验地点的选择,毫无疑问提取方法是影响外周血cfDNA提取物产量最主要的因素。因而,近年来出现许多新兴的外周血cfDNA提取方法,目前应用最为广泛的包括Triton/Heat/Phenol Protocol(THP)及改良并集中上述不同提取原理而成的多种商业化试剂盒。
4.1THP THP提取方法中因涉及Triton-X100洗脱试剂及加热、离心等操作而得名,该方法一般要求血浆样本在DNA分离前于室温(18~22℃)下储存,且储存时间小于2 h。这种方法由于无有害反应试剂,对后续PCR反应抑制小,提取物纯度高及高效、低耗等优点逐渐取代了既往传统的DNA提取方法,在外周血cfDNA提取的相关研究中被广泛应用〔38〕。
4.2商业化试剂盒 此外,目前国内外市场中商业化试剂盒种类繁多,其中以QIAamp®、NucleoSpin®、Norgen®、FitAmp®等为主要代表,其中前两种试剂盒在各类研究中表现均较为出色。QIAamp®试剂盒主要应用于纯化基因组、线粒体、细菌DNA及总RNA和病毒核酸,由于试剂盒中存在特殊的核酸纯化柱、96孔微孔反应板及污物硅胶吸附膜等装置,从而避免了有毒操作并完全去除了二价阳离子、蛋白等聚合酶链式反应(PCR)反应抑制物,再经过缓冲液洗脱后即可得到高度纯化的DNA产物〔44〕。而NucleoSpin®的同样可获得高纯度的提取物并且在小片段DNA的提取中具有较高的提取率〔44〕。
4.3外周血cfDNA提取的方法学比较 目前有研究在各类商业化试剂盒之间及试剂盒与传统提取方法间进行了外周血cfDNA提取效率的对比。但由于研究中样本例数一般较少及受实验室条件等多种因素限制,大多研究结论并不相同,各类文献对此说法不一。目前大多数研究对商业化试剂盒的提取效率给予了肯定。Mauger等〔45〕对比了5种商业化试剂盒及苯酚氯仿(PC),麦格纳纯紧凑型(MPC),THP等传统提取方法间外周血cfDNA的提取效率,发现这些商业化剂盒的整体提取效率几乎均高于传统方法,其中QIAamp®、Norgen®两种试剂盒的优势较为显著,而Norgen®所获DNA产物更多,样本需求少,重复性更好。Devonshire等〔46〕则发现在QIAamp®、NucleoSpin®及FitAmp®的4种试剂盒中,QIAamp®CNA (circulating nucleic acid)试剂盒和NucleoSpin®NS(Plasma XS)试剂盒更加适合小片段DNA的提取,且均能获得数量可观的DNA产物。Page等〔39〕的研究中也称与其他试剂盒相比,QIAamp®CNA试剂盒在小片段DNA提取中更有优势。但有研究〔47〕称高产量的DNA提取物中含有的PCR反应抑制剂(如血液防腐剂等)可能更多,那么这是否会对后续PCR反应产生抑制作用呢?为了解释这个问题,Devonshire等〔46〕再次对上述两种试剂盒所提取的DNA产物进行了探针及染料PCR反应,发现随着每微升DNA提取产物对血浆样本需求量的增加,NucleoSpin®NS试剂盒对PCR反应的抑制作用基本无变化;而QIAamp®CNA试剂盒在每微升DNA提取产物对血浆样本需求量达125 μl时,其对后续探针PCR反应的抑制作用开始增强,当样本需求量达250ul时,其抑制作用基本达峰值。其次,也有研究〔38,48〕称MPC及THP等传统方法比试剂盒的提取效率更好,但目前应用上述两种方法的研究较少,因此该结论可能并不具有代表性。
综上所述,外周血cfDNA的来源途径及存在方式等机制目前已基本明确,其作为新兴的“肿瘤液体活检”手段将在未来最大化的实现恶性肿瘤的精准医学及个体化治疗。然而,目前多数外周血cfDNA的检测仍停留在实验研究阶段,总结目前研究中外周血cfDNA提取前的样本采集、预处理、储存等操作流程对后续检测结果的影响及甄选最优的提取方法将推动未来肿瘤转化医学的发展及外周血cfDNA标准化临床检测流程的建立。