microRNA对干细胞调控作用的研究进展

张念平 刘浩 龙大宏

(1山东中医药大学，山东 济南 250011；2广州医科大学；3济南市第三人民医院)

核糖核酸(RNA)，是广泛存在于生物体内的重要遗传信息载体。其中，能翻译成蛋白质的RNA分子称为编码RNA，也称信使RNA(mRNA)，不能翻译成蛋白质的RNA分子称非编码RNA(ncRNA)。微小RNA(miRNA)是ncRNA的一种，于1993年首次在线虫体内发现〔1〕。随着研究的不断深入，人们发现microRNA在基因转录后的调控方面发挥重要作用，它广泛参与细胞间信号传导及参与细胞代谢、生长、增殖、分化、凋亡等多方面的生物进程。当microRNA调控功能发生障碍，可能导致一些基因的异常表达〔2〕。

干细胞是一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能的细胞。干细胞对重建或修复衰老病变的组织器官方面有着巨大的潜力，细胞替代治疗已成为当代医学研究热点之一。然而，干细胞的分化过程十分复杂，受多种诱导因子和细胞信号通路的调控，具体分化机制仍然不清楚。在干细胞分化过程中细胞多种miroRNA含量有着剧烈的变化，其含量或上调或下调〔3,4〕。另外有研究发现，人为干预microRNA的表达也能显著影响干细胞的分化。这提示干细胞的分化过程受microRNA的调控〔5,6〕。本文就microRNA对干细胞的调控作用进行综述。

1 microRNA的命名规则

microRNA数量众多，为了便于阅读文献，有必要在此简单介绍microRNA的命名规则。除了最早发现的let-7和lin-4以外，其他成熟microRNA现在都用“miR-#”来表示，而相对应的编码基因则用“mir-#”或“MIR-#”表示〔7〕。#代表数字，表示microRNA发现的先后顺序。一般在mir-#前面加三个字母的前缀来区分物种来源，然而有些文献描述microRNA时也常常忽略此前缀。如：hsa(Homo sapiens)表示人类，mmu(Mus musculus)表示小鼠，hsa-miR-101，代表人miR-101。高度同源的microRNA在命名时常于数字后面加一个小写英文字母进行区分，例如mmu-miR-10a和mmu-miR-10b。位于不同位点而编码相同的microRNA基因，在后面加一个数字后缀进行区分，例如hsa-miR-521-1和hsa-miR-521-2。如果从同一个前体的2个臂分别加工产生microRNA，一般根据克隆试验已知相对表达量，以“*”号表示表达量相对较低的microRNA，比如hsa-miR-520d和hsa-miR-520d*。当不能区分表达量多少时，则采用后缀标注其起源的发夹臂端，例如mmu-miR-292-3p表示起源于发夹结构的3′端，而mmu-miR-292-5p代表来源于5′端〔8〕。

2 microRNA的特征

microRNA是一类内源性非编码单链RNA分子，在真核生物中广泛存在，其本身不具有开放阅读框，一般不能编码蛋白质。microRNA通常的长度一般为22个核苷酸左右，但在3' 端因有poly A 尾的结构，因此长度上可有1～2 个碱基的变化，可通过Northern印迹检测到。成熟microRNA 的5'端有单一磷酸基团，而3'端则为羟基，这是与相同长度的功能RNA降解片段区分的标志。microRNA能以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在，而都以成簇排列为主，其基因经常协同表达。microRNA具有明显的特异性，即microRNA的表达谱和序列特征在不同的组织和不同的细胞中表达不同。这些microRNA可能可以作为细胞或组织的特异性标志物。处于不同发育阶段的细胞microRNA组成不同，在特定发育阶段的细胞会出现特定的microRNA，这决定细胞的分化方向及分化时相，同时也表明microRNA的表达具有一定的时序性。microRNA的表达及作用都具有高度的保守性，在不同种属、不同组织及不同细胞中，相同或相似的microRNA 分子具有相似的调控功能〔9〕。microRNA作用具有多靶点性(网络性)特点，即在生物体内一个microRNA可以作用于多个靶mRNA，而单个靶mRNA也可以同时受多个microRNA调控。因此microRNA的调控作用很可能是一种调控网络，它需要接受某些信号的刺激，从整体上调控有机体。

3 microRNA的形成过程和作用机制

在哺乳动物中，细胞核内编码microRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录生成初级转录产物microRNA前体(pri-microRNA)，进而在细胞核内被RNaseⅢ核酸内切酶Drosha和其调节亚基DGCR8蛋白组成的复合物加工成长约70～100个核苷酸的pre-microRNA〔10〕。然后pre-microRNA被RAN蛋白-三磷酸鸟苷结合物(RAN-GTP)和exportin 5转运到细胞质内，在核酸酶Dicer的作用下，剪切形成microRNA:microRNA*双链配对结构。此双链结构在解旋酶的作用下解链，其中一条链被降解，另一条为成熟的单链microRNA(多为具有5'端小突起的一条链)。成熟的microRNA与Argonaute蛋白(AGO1)蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体(RISC)〔11〕。进而通过microRNA 5'端与靶mRNAs 的3'端非翻译区(3'UTR)特异性的碱基配对，降解mRNA或阻遏mRNA的翻译,在转录后水平调控蛋白的表达。

RISC对目的mRNA的作用机制主要有三种。当microRNA与靶mRNA不完全互补结合时，可以抑制靶mRNA的翻译但不影响其稳定性，此种方式在动物中多见，如线虫lin-4。当microRNA与靶mRNA完全互补结合时，靶mRNA最终降解，此种方式常出现于植物中，如拟南芥miR-171。第三种作用方式包含了以上两种作用机制，当microRNA与靶mRNA完全互补结合时，可直接靶向切割mRNA，如HeLa细胞和果蝇中的let-7可直接介导RISC分裂切割靶mRNA。当microRNA与靶mRNA不完全互补结合时，可起到调节基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA的3'UTR不完全互补结合后，可抑制基因翻译〔12〕。由于microRNA可以结合到靶mRNAs的3'UTR来发挥调控作用，因此一个microRNA可以有上百个靶mRNA，而一个靶mRNA也可能被多个microRNA调控。据估计，microRNA调控超过60%的蛋白编码基因〔13〕。

4 microRNA对干细胞的调控作用

目前已经从哺乳动物中发现数百个microRNA，其中一些microRNA与干细胞类型相关，其在细胞内的含量随干细胞的分化而发生改变。通过研究microRNA在干细胞中的作用，可进一步揭示干细胞增殖及分化过程的内在机制。

胚胎干细胞(ESCs)具有无限的自我更新能力及分化成其他类型细胞的能力，研究发现microRNA与ESCs自我更新和分化方面有密切的关系。在未分化的ESCs中，仅有少数几种microRNA高度表达：在鼠ESCs中为miR-292 和miR-302 家族；在人ESCs中为miR-371 和miR-302 家族〔1〕，这些microRNA可能在维持ESCs的特性方面发挥作用。另外有些microRNA对ESCs的分化起促进作用，如miR-1和miR-133 可促进ESCs向中胚层方向分化，miR-9可促进ESCs向神经细胞方向分化。miR-9通过抑制核受体核受体无尾蛋白(TLX)对神经干细胞的增殖进行负调控，并促进神经干细胞的分化。而当表达缺少miR-9识别位点的TLX时，可以挽救miR-9所引起的细胞增殖障碍，并能抑制神经干细胞的分化。这提示miR-9和核受体TLX形成了一个负调节环路，维持神经干细胞的增殖和分化的平衡〔14〕。此外miR-9对神经祖细胞的增殖、迁移也有着调节作用。人ESCs分化为神经祖细胞时，其细胞内的miR-9表达被激活，同时miR-9也能促进神经祖细胞的增殖，在神经祖细胞分化为神经细胞后，miR-9仍然持续表达。体外实验中miR-9的减少可以抑制神经祖细胞的增殖，但却能促进神经祖细胞的迁移。当把无miR-9活性的神经祖细胞移植入胚鼠脑内或脑卒中模型的成年小鼠脑内，这些细胞仍然显示出较强的迁移能力。然而，尽管miR-9是完全保守的序列，但它在不同的生物体内表达的模式和功能有着显著的不同〔15〕。另外，microRNA在ESCs的细胞周期调控中起重要作用。ESCs细胞周期的特点是G1期很短，干细胞能很快进入S期。而Dicer酶突变的ESCs表现出明显的增殖缺陷，处于G0期和G1期的细胞小幅度增多。狄乔治综合征关键区域基因(DGCR)8敲除的ESCs多停滞在G1期，虽然形态上看起来正常，也表达ESCs的特异性标志物，但细胞倍增时间延长〔16〕。

诱导多能干细胞(iPSCs)是在形态、基因和蛋白表达、细胞增殖能力、分化能力等方面都与ESCs相似的一类细胞。将四种转录因子基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)以病毒载体导入已分化的体细胞中，使细胞重新编程，可以得到具有多向分化潜能的iPSCs。然而这种方式诱导效率较低，近几年有研究尝试使用microRNA与转录因子共同诱导体细胞重编程，取得了较好的效果。在使用三个外源性转录因子Sox2、Klf4、Oct4的同时，过表达两个microRNA家族：miR-106a-363及miR-302-367，可以有效提高小鼠成纤维细胞诱导为iPSCs的效率〔17〕。除此以外，有些microRNA对iPSCs的定向分化也有促进作用。Lahmy等〔18〕报道使用人包皮成纤维细胞重编程为iPSCs，在没有其他诱导因子的情况下，以慢病毒为载体将miR-375在iPSCs中过表达，通过形态学评估、免疫细胞化学、胰岛标志基因表达分析发现，从过表达miR-375的iPSCs中可以得到胰岛素样细胞，而且这些胰岛素样细胞还能分泌胰岛素。塞特1基因(Sirt1)是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的组蛋白脱乙酰酶，与细胞的增殖、分化、衰老、凋亡和代谢密切相关。miR-34a是第一个被发现对Sirt1有调控作用的microRNA。miR-34a可以通过结合在Sirt1 mRNA的3′UTR上，从而减少Sirt1的表达。研究发现Sirt1对iPSCs向神经干细胞起负调控作用，即抑制iPSCs向神经干细胞分化，并且这一过程可能被miR-34a调控。当Sirt1表达下降时，miR-34a表达反而升高。当抑制Sirt1时，能增强iPSCs向神经干细胞的分化并促进成熟神经细胞的形成。因此在iPSCs分化过程中，通过miR-34a对Sirt1 mRNA转录后的调控作用，可以抑制Sirt1的表达，这样可以获得更多的神经干细胞和神经细胞〔19〕。

miR-122是第一个被鉴定的肝特异性microRNA分子，它在肝脏中高度表达，其表达量约占肝脏中所有microRNA的70%，而在其他组织器官中表达很低甚至检测不到。它在肝脏胚胎发育、肝细胞生长及表型维持、应激反应、病毒感染、胆固醇与脂肪酸代谢等多种生物学过程中起着重要的调节作用。有研究通过携带miR-122的重组腺病毒表达载体转染ESCs源性肝前体细胞，发现转染miR-122后细胞肝特异性基因如ALB、TTR、AAT、G-6-P、CK8、CYP7A1和CYP3A4的mRNA表达水平明显升高。这表明转染miR-122后，细胞在功能学上接近成熟肝细胞水平，miR-122能有效地促进小鼠ESCs源性肝前体细胞的分化和成熟〔20〕。miR-199a-5p是另外一种在ESCs向干细胞分化过程中起作用的microRNA，它在肝样细胞中表达最高，其次是胎肝，成熟肝细胞中含量最少，几乎检测不到。miR-199a-5p对小鼠和人的ESCs分化起负调节作用，抑制miR-199a-5p能增强小鼠和人的ESCs向肝细胞分化。SMARCA4和MST1是miR-199a-5p的靶基因，在肝脏再生过程中能增加肝细胞的生成。降低miR-199a-5p的表达，导致SMARCA4和MST1表达上调，从而促使胚肝发育时期肝细胞形成〔21〕。

microRNA对造血过程也有调控作用，参与调节原始造血祖细胞多能性的维持和造血过程早期和晚期阶段中细胞的分化。有些microRNA在造血干细胞(HSCs)和造血祖细胞(HPCs)内表达，并发挥调控造血细胞分化功能，如miR-22、miR-29、miR-125和miR-126，在有些急性骨髓性白血病患者中，这些microRNA出现失调〔22〕。目前很多研究认为miR-125家族(包括miR-125a、miR-125b1、miR-125b2)能增强干细胞的自我更新能力。miR-125家族在造血祖细胞中有较高的表达，以减少细胞的分化。然而miR-125家族的靶基因目前还不十分清楚，有可能是促凋亡的基因及与p53信号通路相关的基因。与红细胞生成有关的microRNA有miR-15a、miR-24、miR-144、miR-451等。其中miR-24、miR-27a、miR-451能调控红系转录因子GATA-1和GATA-2的表达，这两种转录因子能促进造血干细胞向髓系分化〔23〕。在脐血CD34+造血祖细胞向红系发育过程中,miR-221和miR-222表达逐渐下降，这能促进红系发育。当过表达这两个microRNA后，能造成红系增殖和分化障碍。另有研究表明miR-223与其他转录因子共同调控粒细胞的分化，过度表达miR-223能促进粒细胞的分化过程〔24〕。

骨形成过程也受microRNA的调控。在骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化过程中miR-125b是明显降低的〔25〕。Smad4 是骨形态发生蛋白(BMP)/转化生长因子(TGF)-β骨形成信号通路中的关键因子，miR-125b 通过抑制靶基因Smad4 的表达，抑制BMSCs向成骨细胞分化。通过向BMSCs细胞中转染miR-125b，双荧光素报告检测显示miR-125b能特异性地与Smad4 mRNA 的3′UTR 结合，抑制Smad4表达〔26〕。相反，向BMSCs细胞内转染miR-125b抑制物，可以促进BMSCs细胞的成骨分化，这间接证实了miR-125b对BMSCs细胞成骨能力的抑制作用〔25〕。另外miR-30家族通过对靶基因Smad1和Runx2的抑制，对成骨细胞的分化进行负调控。过表达Smad1和Runx2可以显著消除miR-30对成骨分化的抑制作用〔27〕。此外，microRNA还在脂肪基质细胞分化、神经干细胞分化、皮肤干细胞分化等诸多方面发挥不同的调控作用。

5 展望

干细胞具有自我更新能力及增殖分化的能力，干细胞的这些特性为细胞移植治疗衰老、损伤的组织带来了希望，干细胞的相关研究工作一直在如火如荼的进行着。干细胞应用于临床之前，首先需要解决干细胞定向分化这一难题。干细胞在生物体内所处的微环境十分复杂，许多因素影响着干细胞的增殖分化。microRNA对干细胞增殖分化的调控作用已经被很多研究所证实，其中一些方面的研究已经取得了可喜的成果。但是由于microRNA数量众多，并且一个microRNA可能对数百个靶mRNA起调控作用，而一个靶mRNA可以被多个microRNA所调控，此外，microRNA还可能与其他信号通路中的相关因子发生联系，因此microRNA对干细胞的调控机制异常复杂，仍然存在着很多未知领域需要去研究。但是，我们相信随着对microRNA研究的不断深入，最终将会揭示其调控干细胞的具体作用机制。