孕妇外周血无创产前检测失败的原因分析及妊娠追踪

卢婉 刘艳秋 黄婷 黄婷婷 周吉会 阳彦

江西省妇幼保健院产前诊断中心（南昌330006）

近年来，随着二代测序技术的发展，基于孕妇外周血中的胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的无创产前检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）技术因高特异性、高敏感性、无创伤的特点已广泛应用于产前筛查。NIPT通过采集孕妇外周血，对其血浆中的游离DNA片段（包括cffDNA）进行测序，结合生物信息分析，计算胎儿患染色体非整倍体的风险，其对21-三体、18三体和13三体的综合检出率已高达98%［1-2］，已成为产前筛查与诊断的重要手段。

然而在实际工作中，NIPT检测失败仍是不能被忽视的一个问题。除去实验环境、操作技术等外在因素，NIPT检测的成功与否更多的是依赖于母体外周血中cffDNA的浓度。若母血中cffDNA浓度未达到最低要求4%，则相对高浓度的正常母体DNA会影响检测结果的准确性，此时通常要求孕妇重新采血再次检测。若重采血的cffDNA浓度仍未达到要求，则视为NIPT检测失败。NIPT的失败极可能延误非整倍体疾病的诊断，给孕妇带来巨大的困扰。有研究［3-4］表明，cffDNA的浓度受孕妇孕周数、体质量指数（BMI）、妊娠期并发症及胎儿染色体核型等多因素的影响，因此探讨NIPT失败原因及引起cffDNA低浓度的因素对协助产前诊断、制定个体化的产前遗传学检测方案，具有重要的临床意义。据文献［5-9］报道，NIPT的失败率约在1%～2%之间，而国内对NIPT的报道大多集中在其高敏感性及阳性预测值上，缺乏失败率的统计。为了解江西地区NIPT的整体数据，本文对2017年1月至2018年12月的23 704例孕妇进行回顾性分析，针对NIPT未获得有效结果的孕妇进行妊娠随访，统计NIPT的失败率，总结并分析其失败的原因，希望有助于进一步完善NIPT技术规范。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2017年1月至2018年12月于江西省妇幼保健院就诊，经知情同意后进行NIPT检测的孕妇23 704例。孕妇年龄18～43岁，孕龄13～28周，对于大于22+6孕周的孕妇在签署同意书的情况下进行。纳入标准及排除标准均参照国家卫生和计划生育委员会《孕妇外周血游离胎儿DNA产前筛查与诊断技术规范》［8］。纳入标准：血清学筛查风险值介于高风险与切割值1/1 000之间、介入性产前诊断禁忌症以及错过血清学筛查最价时间要求自愿检测的孕妇。排除标准：孕周＜12周、夫妻双方一方有明确染色体异常、近期接受过异体输血或免疫治疗等外源性DNA介入、超声结构异常提示需行产前诊断、有基因遗传病家族史、孕期合并恶性肿瘤。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）、定量试剂QubitTMdsDNA Assay Kit（Invitrogen）、定量试剂 QubitTMssDNA Assay Kit（Invitrogen）。全自动制备系统BGISP-300（MGI）、全自动样本加载系统BGIDL-50（MGI）、基因测序仪 BGISEQ-500（MGI）、PCR仪（ABI VERITI）。

1.2.2 标本采集游离DNA保存管（Geneseek）采集孕妇静脉血10 mL，96 h内分离血浆，避免溶血、脂血及标本污染。分离流程：4℃1 600g离心10 min分离血浆取上清，4℃16 000g离心10 min去除管底红细胞，分离上清至3只EP管中，每管至少500 μL。血浆于-20℃暂存（保存1周），-80℃保存3年。

1.2.3 孕妇外周血胎儿游离DNA的提取、建库、测序严格按照核酸提取试剂盒说明书提取胎儿游离DNA，cffDNA经末端修复和连接反应得到连有接头标签的双链DNA分子，再经过PCR扩增得到DNA文库；每个DNA文库按等质量进行pooling，最终得到一份3.5 ng/μL的pooling产物。选用胎儿染色体非整倍体试剂盒（T21，T18，T13）试剂盒以高通量测序仪BGISEQ-500检测，采用光学拍照的方式对激发荧光信号的碱基进行光学捕获，得到相应的碱基序列，即测序结果。将每条DNA片段测序所得的序列与人类基因组进行比对，通过生物信息学分析，计算胎儿患性染色体非整倍体疾病的风险值。

1.2.4 NIPT结果处理依据生物统计学的原理，将测序结果与人类基因组数据库进行数据比对，利用NGS技术进行信息分析，判定21、18、13号染色体的数量。提示“灰区”和质控不通过的样本，利用原标本重新检测；胎儿浓度低以及两次建库均提示灰区的样本，经知情同意后需重取样进行检测。两次取样检测仍未取得有效结果的，电话告知孕妇并建议其进行产前诊断。

1.2.5 羊膜腔穿刺与核型分析对孕16～24周孕妇行羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL，经培养后按常规方法制片，G显带，分辨率为320～400条带［8］。使用莱卡染色体核型扫描分析系统，计数30个核型，至少分析5个核型，嵌合体病例计数至少50个核型。按照人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2016）的标准命名核型。

1.3 妊娠随访于2019年6月对孕产妇进行电话随访，详细记录孕妇产前诊断结果，孕期并发症以及新生儿身体状况。

1.4 统计学方法所有数据采用SPSS 21.0统计学软件进行处理，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NIPT检测结果23 704例样本中需重取样154例，单次采血失败率为0.65%。其中因游离胎儿DNA浓度低需重取样共计88例，两次建库Z值处于“灰区”61例，因GC孤立等质控因素重取样5例。7名孕妇因个人原因拒绝重取样，3例胎儿丢失，实际重取样144例，111例获得有效NIPT结果，总失败率为0.14%（33/23 704）。失败的33例样本中，24例cffDNA浓度仍然低于检测范围，8例仍处于“灰区”，1例未知原因导致多条染色体离群，均电话告知孕妇进行产前诊断。

2.2 首次需重新取样的154例样本信息在154例需要重新取样的病例中，cffDNA浓度低及Z值处于“灰区”是两个主要的原因，占比分别是57.1%（88/154）和39.6%（61/154）。在88例胎儿浓度低的样本中，双胎妊娠12例，BMI＞25的15例，有妊娠期并发症的5例，检测前有肝素治疗的3例。在61例Z值处于“灰区”的样本中，双胎妊娠6例，BMI＞25的10例，有妊娠期并发症的8例，检测前有肝素治疗的7例（表1）。

表1 需重新取样的154例样本的临床资料Tab.1 Clinical data of 154 patients requiring re-sampling ±s

表1 需重新取样的154例样本的临床资料Tab.1 Clinical data of 154 patients requiring re-sampling ±s

原因分布cffDNA浓度低Z值处于“灰区”Z13“灰区”Z18“灰区”Z21“灰区”Z13.21“灰区”质控因素总计例数88 61 8 21 31 BMI（kg/m2）23.80±3.54孕周数（周）16.31±1.22备注双胎妊娠12例；BMI＞25 15例；妊娠并发症5例；肝素治疗3例23.31±2.90 16.65±1.67双胎妊娠6例；BMI＞25 10例；妊娠并发症8例；肝素治疗7例1 5/154占比（%）57.14 39.61 5.19 13.63 20.13 0.64 3.25 100 16.34±0.84 16.46±1.57 23.36±2.61 23.74±3.67双胎妊娠18例；BMI＞25 25例；妊娠并发症13例；肝素治疗10例

2.3 最终NIPT失败的33例样本的临床资料144例重新取样的样本中，最终有33例未获得有效的结果，包括cffDNA浓度低所致24例、Z值处于“灰区”8例及MCA 1例。在24例cffDNA浓度低的样本中，双胎妊娠3例，BMI＞25的11例，有妊娠期并发症的3例，检测前有肝素治疗的1例。在8例Z值处于“灰区”的样本中，双胎妊娠1例，BMI＞25的3例，有妊娠期并发症的3例，检测前有肝素治疗的1例（表2）。

表2 NIPT失败的33例样本的临床资料Tab.2 Clinical data of 33 cases of NIPT failure ±s

表2 NIPT失败的33例样本的临床资料Tab.2 Clinical data of 33 cases of NIPT failure ±s

原因分布cffDNA浓度低Z值处于“灰区”Z13“灰区”Z18“灰区”Z21“灰区”Z13.21“灰区”质控因素总计例数24孕周数（周）17.60±1.32 BMI（kg/m2）25.20±3.22备注双胎妊娠3例；BMI＞25 11例；妊娠并发症3例；肝素治疗1例8 1 2 5 0 1 3 3占比（%）72.73 24.24 3.03 6.06 15.15 0 3.03 100 17.31±1.5624.81±2.89双胎妊娠1例；BMI＞25 3例；妊娠并发症3例；肝素治疗1例///17.42±1.6425.17±3.14双胎妊娠4例；BMI＞25 14例；妊娠并发症6例；肝素治疗2例

2.4 重新取样并获得有效NIPT结果的111例样本两次临床资料的比较二次取样有111例样本最终获得有效的NIPT结果，包括原cffDNA低的58例、原Z值处于“灰区”的49例及原质控因素的4例。比较这111例样本检测成功前后的临床资料后发现，平均孕周数由（17.21±1.54）变为（19.65±1.21）周，平均体质量指数由（23.26±3.15）kg/m2变为（23.92 ± 3.70）kg/m2，肝素治疗者由4例变为1例，双胎妊娠及妊娠并发症例数前后没有变化（表3）。

2.5 NIPT检测失败的随访结果24例胎儿浓度低检测失败的孕妇中2例失访，1例因孕期并发症放弃生产，1例因胎儿超声结构异常引产，5例补做血清学筛查/NIPT，10例行羊膜腔穿刺术，未做任何处理者5例。10例羊膜腔穿刺术中检出1例 47，XN，+21和 1例 46，XN，t（1；16）（p32；q12），其余8例均未见异常（表4）。8例处于“灰区”的孕妇除1例双胎因担心手术风险拒绝手术，其余均进行羊膜腔穿刺术，检出1例47，XN，+21（表5）。

表3 重新取样后NIPT检测成功的111例样本临床资料变化表Tab.3 Changes of clinical data of 111 cases with successful NIPT detection after resampling ±s

表3 重新取样后NIPT检测成功的111例样本临床资料变化表Tab.3 Changes of clinical data of 111 cases with successful NIPT detection after resampling ±s

注：与首次取样相比差异有统计学意义，*P＜0.05

临床资料首次取样重新取样孕周数（周）17.21±1.54 19.65±1.21*BMI（kg/m2）23.26±3.15 23.92±3.70肝素治疗（例） 妊娠并发症（例）4 1双胎妊娠（例）13 13 6 6

表4 24例因两次胎儿浓度低检测失败的随访结果Tab.4 Follow-up results of 24 failures due to low fetal concentration

3 讨论

世界卫生组织2011年指出，全球每年约有790万婴儿发生严重的出生缺陷疾病。近年来，我国随着“二孩政策”的开放，高龄孕产妇比例增加，随之伴随的出生缺陷总量增加，约为出生总人口的5.6%，出生缺陷也成为我国婴儿死亡的主要原因之一［10］。染色体非整倍体异常是常见的出生缺陷，目前尚无有效的治疗方法，因此对孕妇进行产前筛查，对高危胎儿进一步的产前诊断、及时采取处理措施是降低此类出生缺陷的唯一策略。

表5 8例“灰区”随访结果Tab.5 Follow-up results of 8 cases of borderline z-score

NIPT作为临床产前筛查的重要补充，对孕妇外周中游离DNA片段（包括cffDNA）进行测序，通过比对参考序列而获得每条染色体序列位置信息，可同时检测21-三体、18-三体、13-三体以及部分性染色体非整倍体异常。据统计，NIPT对于21、18、13-三体的总体检出率为99.02%，特异性为99.86%，阳性预测值为85.27%［11］。然而，在实际工作中NIPT仍存在待解决的问题。胎儿游离DNA是来源于凋亡的胎儿滋养层细胞，经胎盘屏障时受母体免疫细胞攻击，从胎盘的合体滋养层细胞中进入母血自然降解的DNA片段［12］，因此NIPT检测的母体外周血中胎儿游离DNA要受胎儿和母体两方面的影响。孕妇的年龄、体质量、体质量指数（BMI）、妊娠期并发症、取样时的孕周均会影响cffDNA的浓度。CffDNA的浓度与采血孕周呈正相关性，随着孕周的增加，凋亡的胎盘滋养层细胞增多，释放入血的DNA片段随之增加［3］。孕期的体质量增加，血容量增加会导致外周血中总体DNA含量升高，相对cffDNA浓度降低［6-7］。对于BMI＞40 kg/m2的孕妇，不建议NIPT检测。母体中的胎儿游离DNA浓度过低，异常的胎儿DNA可能受母体正常的DNA影响而无法检出，因此要求孕妇重取样检测。HUDEVOVA等［13］曾在2014年报道，cffDNA越低，异常染色体越不容易检出，因cffDNA浓度低造成NIPT失败的人群胎儿非整倍体的风险更高。SUZUMORI等［14］也曾指出三体的胎儿也会影响胎儿游离DNA的浓度，从而影响NIPT的检测。此外，由于肝素中的部分物质有可能会抑制NIPT检测过程中Taq DNA聚合酶的活性，影响GC含量，因此肝素的使用也是造成NIPT失败的因素之一［15］。

本研究统计了两年来的23 704例NIPT结果，发现NIPT最终失败率为0.14%，低于文献报道［16］。在154例首次需要重新取样的病例中，胎儿浓度低及Z值处于“灰区”是两个主要的原因，占比分别是 57.14%（88/154）和 39.61%（61/154），另外还有5例是质控因素所致。这些样本中包括双胎妊娠18例，BMI＞25的25例，有妊娠期并发症的13例，检测前有肝素治疗的10例。而在最终失败的33例样本中，胎儿浓度低及Z值处于“灰区”仍是主要原因，并且双胎妊娠、BMI值、妊娠并发症及肝素治疗样本仍然占据一定比例。通过再次取样，在154例样本中有111例获得了有效的结果，这期间孕周数由（17.21±1.54）周增加为（19.65±1.21）周，差异有统计学意义，BMI值无明显变化，并且有4例患者检测前停止了肝素治疗，这些因素都提高了NIPT检测成功的可能性。

通过随访追踪发现，24例因胎儿浓度低导致的NIPT失败，10例后经羊水穿刺后检出1例21-三体综合征及1例平衡易位，异常染色体达8.33%。NIPT对于Z值第一次建库在“灰区”的样本按规范重新建库，第二次仍处于灰区的样本要求重取样检测。Z值是测序数据经过处理、GC校正后得到的风险判断值［17］，Z值大于提示高风险，小于-3表示染色体检测值偏低，整体染色体偏少。在随访中笔者发现1例21-三体引产，其余新生儿正常，异常比例为12.50%。此外，实验操作过程中导致的总DNA量低、DNA建库浓度低、测序数据量不足、低胎儿浓度、实验检测流程及其他质控步骤等方面均可导致NIPT检测失败［18］。在本研究中，初次取样发现4例GC孤立和1例多条染色体离群（MCA）两次建库均未通过质控，再次取样后仍有一例提示多条染色体离群。

值得注意的是，随着辅助生殖技术的发展，双胎及多胎的比例逐渐增加。《孕妇外周血游离胎儿DNA产前筛查与诊断技术规范》建议双胎人群慎用NIPT检测。两项关于双胎的数据也表明［19-21］，NIPT对21-三体和18-三体的阳性预测值明显低于单胎。然而“试管婴儿”来之不易，双胎妊娠进行有创产前诊断时更容易导致流产早产，需要承担更大的风险。对于血清学筛查高风险或者高龄的孕妇，NIPT失败后担心手术风险拒绝羊膜腔穿刺。对此，国内外学者通过琼脂糖凝胶电泳富集胎儿片段DNA提高浓度的方法进行NIPT取得了较好的效果［22-23］。

综上所述，NIPT的影响因素众多，孕妇的年龄、体质量指数、妊娠期并发症、取样时间、母源性染色体核型异常均会导致NIPT结果不一致［24-25］。实验技术人员应严格按照规范操作，临床医生需要为孕妇提供准备的详细咨询，对于不符合NIPT收样的人群应根据个人情况建议行产前诊断。