Luminal型乳腺癌中PD-L1的表达特点及预测价值

郝语晨 毕恺欣 刘晓青 徐毅 陶新楠 张亚芬山西医科大学（太原030000）；山西医科大学附属人民医院（太原0300）

国际癌症研究中心发布的2018年全球癌症统计报告显示乳腺癌居于全球女性癌症发病率首位，而我国人口基数庞大是不容忽视的乳腺癌大国［1］。根据世界癌症生存研究CONCORD发布的最新数据，我国乳腺癌年龄标化生存率为83.2%，比澳大利亚、美国等西方发达国家的同期数据落后6%左右［2］，延长生存时间、降低病死率是我国乳腺癌疾病管理的重点。PD-1/PD-L1检查点（programmed cell death-1/programmed death ligand-1 checkpoint）及其抑制剂是最近几年肿瘤免疫学中备受瞩目的研究热点［3-4］，其理论基础是肿瘤的免疫逃逸机制：正常生理条件下，人体免疫系统存在促进自我耐受防止自身免疫的机制，即T细胞被激活时其表面PD-1表达增加，而攻击性炎症因子IFN-γ、TNF-α等刺激特异性免疫细胞表达其配体PD-L1和PD-L2，其中主要为PD-L1，当PD-1与其配体PD-L1结合时，经过一系列酶联反应抑制下游的PI3K/AKt/mTOR通路，进而抑制T细胞功能，而肿瘤细胞恰恰习得这种逃避免疫攻击的方法，在其细胞表面大量表达PD-L1，实现免疫逃逸，参与肿瘤增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为［5-6］。

肿瘤组织中肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）均有PD-L1表达［5-6］，本研究关注PD-L1在上述两类细胞的表达特点，分别探索对生存预后有无预测价值。PD-L1在三阴性、Her-2过表达型乳腺癌的预后预测价值已被大量研究［7-13］证实，即PD-L1表达越多，提示预后越差。然而三阴性、Her-2过表达型并非最常见亚型，仅占乳腺癌总体的不到30%，上述研究发现的普适意义有限，因此笔者认为，进一步研究最常见亚型（即Luminal型）对临床的预后预测和治疗指导意义更大。为避免Her-2阳性患者赫赛汀治疗不规范影响预后分析，本研究仅纳入Luminal（Her-2阴性）型病例。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究为历史前瞻性研究。本研究入组2013年1-12月于山西省人民医院乳腺外科住院治疗的乳腺浸润性导管癌病例。纳入标准：（1）女性；（2）乳腺癌分期较早可行规范手术治疗者；（3）病理类型为浸润性导管癌；（4）分子类型为Luminal（Her-2阴性）型；（5）相关病例资料完善。排除标准：（1）本次诊断为双侧乳腺癌；（2）既往或本次治疗期间有乳腺或其他原发恶性肿瘤病史；（3）因患者无法承受或患者意愿等行姑息性手术者；（4）内分泌治疗不规范。

1.2 方法

1.2.1 临床数据年龄（以身份证出生年月为准）；月经状态（绝经定义为双侧卵巢切除术后/年龄≥60岁/年龄＜60岁，自然停经≥12个月/FSH和雌二醇处于绝经后范围）；乳腺/妇科合并症（定义为乳腺纤维瘤、乳管内乳头状瘤/子宫肌瘤、卵巢囊肿等与雌性激素紊乱相关的乳腺/妇科良性疾病）；家族史（定义为直系亲属有恶性肿瘤病史）。

1.2.2 病理数据病理学分级、ER%、PR%、TIL%、Ki-67、TNM分期（依据AJCC第九版，记为Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期）、分子分型［将Luminal型分为Luminal A型，即ER和/或PR阳性、Ki-67＜14%且Her2阴性；Luminal B（Her2-），即ER和（或）PR阳性、Ki-67≥14%且Her2阴性］。

1.2.3 治疗情况手术时间及方式、术后辅助治疗类型、具体药物方案。

1.3 免疫组化本研究采用免疫组化二步法。PD-L1抗体试剂选用中山金桥兔单克隆一抗，克隆号为SP142。PD-L1在肿瘤细胞膜和/或细胞质表达记为TC（tumor-cell），在TILs表达记为IC（immuno-cell），采用David E等的评分方法［14］，即计算PD-L1表达细胞在肿瘤区域的占比，以百分比表示（即TC%/IC%）；选取1%、5%、10%为截点，即＜1%记为TC/IC0分，≥1%且＜5%记为TC/IC1分，≥5%且＜10%记为TC/IC2分，≥10%记为TC/IC3分。TC和IC的cut-off值均为1，即0分为阴性表达，1、2、3分为阳性表达。

查阅病理报告并记录病理学分级，调取原始H&E切片判读ER%、PR%、Her-2±FISH、Ki-67、TIL%。ER、PR判读参照我国《乳腺癌雌、孕激素免疫组织化学检测指南（2015版）》。Her-2判读采用2017年ASCO-CAP会议发布的最新指南［15］。TILs%判读根据国际TILs工作组2015年版的推荐进行［16］。阅片结果由高年资病理科医师审核确认。

ER%、PR%、Ki-67采用SOFT&TEXT试验［17］的截点进行分层，即：ER%分层为＜50、≥50；PR%分层为＜20、20～ 49、≥ 50；Ki-67分层为＜14、14～ 19、20～25、≥26。病理学分级分为1/2/3级。TIL%选取30%、60%为截点，即＜30%记为TIL（1+），≥30%且＜60%记为TIL（2+），≥60%记为TIL（3+）。

1.4 随访通过电话、门诊等方式随访患者院外内分泌治疗情况及生存情况。生存事件定义为与乳腺癌疾病进展相关的死亡。随访时间为开始内分泌治疗到内分泌治疗满5年。计算总生存期（overall survival，OS）。

1.5 统计学方法使用SPSS 25.0进行分析，计量资料以均数±标准差表示，对其进行正态性检验，符合正态性分布者进行独立样本t检验，不符合正态性分布者进行秩和检验。计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。运用Cox生存分析判断复发和生存预后的独立因素。运用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较使用Log-rank检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料本研究共纳入225例Luminal型乳腺浸润性导管癌患者，年龄21～78岁，平均（51.17±11.32）岁，中位年龄50岁；左乳癌109例，右乳癌117例。5年生存率为88.9%（200/225）。OS事件23例；删失19例，其中16例失访，3例死于其他疾病。

2.2 肿瘤组织中PD-L1表达特点PD-L1在肿瘤细胞和TILs均有表达，见图1。225个样本中有86（38.2%）个样本的肿瘤细胞PD-L1阳性表达，24（10.7%）个样本的TILs PD-L1阳性表达。纳入指标的赋值见表1。

图1 PD-L1在乳腺癌组织的表达Fig.1 PD-L1 expression in breast cancer tissue

表1 相关因素赋值说明Tab.1 Related factors and assignment instructions

2.2.1 PD-L1的表达与临床指标的关系对年龄、月经状态、合并症、家族史、分期分析显示：肿瘤细胞和TILs中PD-L1的表达仅在不同分期时差异具有统计学意义，见表2。

2.2.2 PD-L1的表达与病理指标的关系对ER%、PR%、Her2状态、TIL评分、Ki-67、分子分型统计学分析显示，不同PR%、TIL评分、Ki-67、分子分型的PD-L1在肿瘤细胞和TILs的表达差异具有统计学意义（P＜0.01），另外ER%（P=0.046）也是TILs中PD-L1表达的影响因素，见表3。

2.3 Cox回归分析计算生存状态的危险因素，由结果可见，IC评分（RR=2.375，P＜0.01）、PR（RR=0.926，P＜0.01）、Ki-67（RR=1.026，P=0.01）和病理学分级（RR=4.137，P＜0.01）是生存的独立危险因素，而TC评分在单因素分析时有意义，多因素分析时差异无统计学意义，说明其受其他混杂因素影响，不能独立影响生存预后。见表4。

表2 PD-L1表达与临床指标的关系Tab.2 Relationship between PD-L1 expression and clinical indicators 例（%）

表3 PD-L1表达与病理指标的关系Tab.3 Relationship between PD-L1 expression and pathological indicators 例（%）

表4 生存状态的危险因素分析Tab.4 Risk factor analysis of survival status

2.4 生存情况的比较对生存情况分析发现，IC阳性组患者生存率为37.5%（9/24），低于IC阴性组患者生存率96.0%（193/201），差异具有统计学意义（χ2=117.7，P＜0.001）。生存曲线见图2。

3 讨论

图2 IC阴性组（n=201）和阳性组（n=24）（TILs中PD-L1表达阴性/阳性）的生存曲线Fig.2 Survival curves of IC negative group（n=201）and positive group（n=24）（negative/positive PD-L1 expression in TILs）

既往研究［7，12，18-19］报道 PD-L1 在 Luminal型乳腺癌细胞的阳性率为14.8%～53.1%，本研究中PD-L1在肿瘤细胞阳性率为38.2%，与上述报道基本一致。之前的研究［12，18，20］仅统计肿瘤细胞中PD-L1的表达，或不区分肿瘤细胞和TILs，笼统地记为肿瘤组织的表达［21］，据笔者所知，大部分学者没有关注PD-L1在TILs的表达并作为一个独立指标进行研究，因而其阳性率鲜有报道。笔者认为肿瘤微环境的主要有形成分为肿瘤细胞和TILs，综合考虑两者的PD-L1表达情况不仅能反映肿瘤的免疫逃逸能力，而且能够研究免疫系统的应答状态，与单独研究肿瘤细胞相比更为严谨科学。目前肿瘤细胞阳性表达的判读标准不尽相同，有的研究［7，21］仅认可细胞膜的着色，而有的研究［10，12，18，22］将细胞膜和/或细胞质的着色均判定为阳性表达，因此相关研究结果可比性较低，难以汇总分析形成大数据支持的结论，亟待统一公认的判读标准。

本研究发现：PD-L1表达水平与病理学分级、ER、PR、Ki-67、分期显著相关，PD-L1阳性组织较阴性组织病理学分级较高、ER%较低、PR%较低、TIL评分较高、Ki-67较高、分期较晚，Luminal B（Her2-）型阳性率显著高于Luminal A型，换言之，无论肿瘤组织或TILs中，PD-L1阳性均提示肿瘤恶性程度较高，预后预期较差，这一结论可用肿瘤免疫逃逸来解释。

单因素和多因素生存分析均显示TIL不是生存的影响因素，与其他研究［8，23-24］的发现一致。而χ2检验提示不同TILs评分组织的PD-L1表达显著不同，TILs中PD-L1的表达是死亡的独立危险因素，因此笔者推测结合TILs和PD-L1能够提供预后预测的额外信息。本研究发现TILs中PD-L1表达是生存的独立危险因素，肿瘤细胞的PD-L1表达仅在单因素生存分析时是独立危险因素，而Luminal A型和Luminal B Her2-型的PD-L1在肿瘤细胞和TILs的表达情况差异具有统计学意义，因此笔者考虑该结论与入组人群中Luminal A型和Luminal B Her2-型相对比例有关，后续研究将对Luminal型进一步细化分析。

PR状态、Ki-67和病理学分级是公认的预后预测因素。PAN等［25］对EBCTCG数据库中500 692例激素受体阳性早期乳癌患者内分泌治疗5年后20年随访研究发现，淋巴结状态在任意时间段都是强预测因子，组织学分级和Ki-67是最初5年预后的重要独立预测因子，但在后续时间段仅具有中等预测效力。ORUCEVIC等［26］根据TAILORx研究的最新结果对复发预测风险评分检验，纳入年龄、肿瘤大小、病理学分级、PR状态和组织学类型分析发现病理学分级和PR状态是5个临床病理特征中复发风险评分高低的最强预测因素。本研究对纳入人群随访5年，生存分析结果与上述研究相一致，由于Luminal型乳腺癌与其他亚型相比5年后仍有较高复发率，笔者将继续随访以获取各个时间段肿瘤浸润淋巴细胞PD-L1表达预测意义的变化。

肿瘤细胞和免疫细胞都能激活PD-1/PD-L1检查点，上调PD-L1的表达，负性调节抗肿瘤免疫反应［20］。目前研究较为透彻的机制主要为两条信号通路的激活［27］：PI3K/AKt/mTOR激活介导的细胞内信号通路和IFNGRs/JAK/STAT激活介导的细胞外信号通路。CHEN等［28］报道IFNγ上调外泌体PD-L1表达水平，抑制免疫和促瘤生长；外泌体PD-L1水平变化能够预测治疗后肿瘤细胞对T细胞再活化的适应性反应水平。笔者认为，TILs和外泌体中的PD-L1水平都能反映肿瘤与免疫系统抗衡的结果，其变化规律是治疗反应性的重要预测因子，对指导临床工作具有重要意义，例如对于需要新辅助治疗的晚期乳腺癌患者，穿刺获取组织中PD-L1的表达情况，为患者初始治疗时选择的个体化治疗方案，未来条件允许时，密切检测血液中PD-L1水平变化，掌握免疫系统受压制程度变化，及时调整用药选择。

综上，PD-L1在TILs的表达对生存预后具有一定的预测价值，可为临床医师预后判断及治疗选择提供一定指导。