川南地区乳腺癌患者人表皮生长因子受体2基因状态及其蛋白表达与临床病理特征的关系

罗斯译 柴利 阮思蓓 凌凤 李昕 高子清 李丽 杨志惠 唐明希西南医科大学（四川泸州644000）；西南医科大学附属医院病理科（四川泸州644000）；广东省妇女儿童医疗中心儿科研究所（广州50000）

乳腺癌为全球女性最常见的恶性肿瘤，已成为全球主要的公共卫生问题之一［1-2］。本文通过国内最新指南《乳腺癌HER2检测指南（2019版）》再评价IHC和FISH检测结果的一致性，并评估新版指南人类表皮生长因子受体2（HER-2）基因状态和蛋白表达及与各临床病理特征关系，为乳腺癌患者正确选择治疗方案和预后评估提供重要参考。

1 资料与方法

1.1 病例资料选取2010年11月-2019年6月经西南医科大学附属医院病理科确诊为浸润性乳腺癌并进行FISH和IHC检测的女性乳腺癌患者1 182例。组织标本主要来源于泸州、宜宾、内江、自贡等川南地区。标本类型为乳腺癌根治手术切除标本1 067例和粗针穿刺标本115例。年龄17～90岁，平均（45.07±9.54）岁。选取的所有病例均有完整FISH报告记录和ER、PR、HER-2/neu等IHC切片以及年龄、肿瘤大小、组织学分级等临床病理资料。根据《乳腺癌HER2检测指南（2019版）》和《乳腺癌HER2检测指南（2014版）》指南中IHC和FISH判读标准对所有病例进行再判读和差异统计分析，FISH再判读主要通过查阅检测报告记录，IHC再判读由2名副教授复阅切片完成。

1.2 试剂与探针IHC中ER、PR和Her-2/neu检测使用罗氏公司抗体（ER克隆号：SP1；PR克隆号：1E2；Her-2/neu克隆号：4B5）；Ki-67抗体（克隆号：MIB.I）由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。FISH检测采用北京金普嘉公司HER-2基因扩增试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 IHC法新鲜标本经10%中性福尔马林固定后石蜡包埋并连续切片3 μm，IHC操作按照En-Vision两步法操作说明进行，以PBS代替一抗作阴性对照。细胞核呈棕色或棕褐色为ER、PR、Ki-67阳性表达，细胞膜呈棕色为HER-2/neu阳性表达。

1.3.2 FISH法按照北京金普嘉公司HER-2基因扩增试剂盒操作说明进行FISH检测，具体的操作步骤如前述［3-4］。

1.4 结果判定

1.4.1 FISH结果判读按照《乳腺癌HER2检测指南（2019版）》［5］FISH判读标准对所有病例进行再评价，双探针FISH判读标准分以下5种情况：（1）第1组，HER2/CEP17比值≥ 2.0，且平均HER2拷贝数/细胞≥4.0；此种情况判为FISH阳性；此外，若HER2信号连接成簇时可直接判断为FISH阳性。（2）第2组，HER2/CEP17比值≥ 2.0，平均HER2拷贝数/细胞＜4.0（此种情况需增加细胞计数，若结果不变，则FISH判读为阴性）。（3）第3组，HER2/CEP17比值＜ 2.0，平均HER2拷贝数/细胞≥ 6.0（此种情况需增加细胞计数，若结果不变，则判读为FISH阳性）。（4）第4组，HER2/CEP17比值＜ 2.0，平均HER2拷贝/细胞数≥4.0且＜6.0（此种情况需增加细胞计数，若结果不变，需对两次结果进行综合判断分析。若仍为上述情况，此类患者需要结合IHC结果，若IHC结果为3+，HER2状态则为阳性。若IHC结果为0、1+或2+，HER2状态应判读为阴性）。（5）第5组，HER2/CEP17比值＜ 2.0，HER2拷贝/细胞数＜4.0，此种情况判读为FISH阴性。

1.4.2 IHC结果判断HER-2/neu蛋白表达强度判读参照《乳腺癌HER2检测指南（2019版）》［5］进行。

1.5 统计学方法数据分析使用SPSS 17.0软件，采用Kappa检验对IHC和FISH检测结果进行一致性分析，HER2基因状态及蛋白表达与临床病理特征关系采用χ2检验及Spearman相关分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 1 182例乳腺癌HER2/neu蛋白表达和HER-2基因扩增情况IHC法检测1 182例乳腺癌患者组织标本，HER-2蛋白表达（-）者22例（1.86%），（+）者146例（12.35%），（2+）者889例（75.21%），（3+）者125例（10.58%），HER-2/neu蛋白表达情况见图1。FISH检测HER-2基因扩增312例（26.40%），无扩增870例（73.60%），FISH检测情况见图2。

图1 HER-2/neu蛋白表达评分结果图Fig.1 IHC scored of Her-2/neu protein expression

图2 FISH结果（CEP 17呈绿色，HER-2呈红色，FISH油镜×100）Fig.2 FISH results（CEP17 stained green and HER-2 gene stained red，FISH oil mirror× 100）

2.2 FISH检测乳腺癌组织HER2/neu蛋白表达与基因扩增结果比较在新标准下：IHC和FISH检测阴性符合率为100%；HER-2蛋白表达（+）与FISH检测阴性符合率为93.84%；HER-2蛋白表达（2+）与FISH检测阳性符合率为25.42%；HER-2蛋白表达（3+）与FISH检测的阳性符合率为61.60%。IHC和FISH检测结果总体一致率为40.06%，存在一致性（Kappa=0.089，P=0.000）且呈正相关（r=0.194，P=0.000），见表1。

表1 FISH及IHC检测HER-2基因状态和蛋白表达新旧指南一致率比较Tab.1 Comparison the coincidence rate of new and old standards for detection of HER-2 gene status and protein expression by FISH and IHC

2.3 1 182例乳腺癌HER-2基因扩增及HER2/neu蛋白表达与临床病理特征的相关性ER、PR、ER/PR表达状态、淋巴结转移数量与HER2基因扩增（χ2=169.047，P=0.000；χ2=73.931，P=0.000；χ2=79.883，P=0.000；χ2=7.752，P=0.021）及HER-2/neu蛋白表达（χ2=47.667，P=0.000；χ2=61.055，P=0.000；χ2=13.646，P＜ 0.05；χ2=11.472，P＜0.05）差异具有显著性（组间比较用卡方检验）；组织学分级与HER-2/neu蛋白表达正相关，而与HER2基因扩增无明显相关性。ER表达与HER2基因扩增及蛋白表达呈负相关（r=-0.360，P＜0.001；r=-0.078，P＜ 0.05），PR、ER/PR状态与HER2基因扩增呈负相关（r=-0.248，P＜ 0.001；r=-0.256，P＜0.001），与HER-2/neu蛋白表达无关（P＞0.05）。此外，HER-2基因扩增与淋巴结转移数量呈正相关。HER-2/neu蛋白表达与肿瘤大小、组织学分级正相关，年龄与HER-2基因扩增及蛋白表达无相关性（P＞0.05，表2）。

3 讨论

HER-2基因是一种具有酪氨酸激酶活性的185 kD跨膜糖蛋白受体，可与HER家族成员形成二聚体而使细胞内激酶活化而诱导细胞增殖［6］，研究发现，约20%乳腺癌患者有HER-2的过表达，而HER-2过表达患者预后较差、转移风险高、生存期较短且对内分泌治疗和标准化疗治疗的效果均不佳［7］。但随着HER-2阳性乳腺癌治疗药物曲妥珠单抗及其联合药物的应用极大地改善了HER-2阳性患者的预后［8］。因此，能否正确检测和评估HER-2状态对乳腺癌治疗方案选择和预后评估极其重要，特别是抗HER-2阳性靶向治疗个体化方案的制定和疗效评估。

本研究结果显示，新指南下本地区HER-2总体蛋白表达阳性率为10.58%，低于杨雅洁（26.35%）［9］及周国江（21.25%）［10］等的报道，可能与本研究IHC（-/+）以及IHC（3+）样本量较少而以IHC（2+）为主有关。新指南下本地区HER-2基因阳性表达率26.40%，与国外报道的15%～30%［11］基本相符，略高于国内张虹等［12］报道的23.05%，但低于要建超（38%）［13］、国风（41.9%）［14］及周国江等报道的43.75%［10］，一方面反映出与新指南结合了HER-2/CEP17比值、平均HER-2基因拷贝数及IHC对HER-2状态进行综合评估和取消“可疑”判读标准有关，同时，也不排除不同地区［15］及种族［16-17］间HER-2阳性表达率可能存在的差异。

新指南下FISH阴性和IHC（-）的符合率为100%，与本文旧标准结果一致，也与其他报道相符［13-14］；FISH阴性和IHC（+）的符合率为93.84%，与旧标准本地区的92.46%和有研究［18］报道的100%，与要建超等［13］报道的93.30%基本一致，提示IHC（-/+）者与FISH结果高度一致；新标准下的FISH阳性和IHC（2+）符合率为25.42%，与GHEYBI等报道的 27.50%［19］及国风等报道的 28.63%［14］一致。本研究与LATEEF等［20］研究结果相同均认为对于IHC（2+）者需常规行FISH检测进一步准确评估HER-2状态；新标准下FISH阳性和IHC（3+）符合率为61.60%，与笔者旧标准的57.6%和笔者已经报道的 54.67%［4］、60.98%［21］及其周国江等报道的 58.82%［10］基本一致，但低于要建超等［13］报道的78.9%，这可能与本研究IHC（3+）样本量较少，且多为5年以前样本而与当时样本固定、IHC检测抗原修复法等因素有关。尽管在新旧指南中均认为IHC（3+）患者明确判读为阳性，但鉴于本研究中IHC（3+）和FISH阳性符合率较低（61.60%），且研究［22］认为FISH相对于IHC而言能更好识别HER-2/neu阳性病例，故IHC（3+）者也建议进一步做FISH检测以明确HER-2状态。因此，笔者认为IHC（2+/3+）者都应进一步行FISH检测，以完善诊断并指导治疗和判断预后。新指南考虑IHC对HER-2的影响，并取消了HER-2“可疑状态”的判读标准，使临床对乳腺癌患者靶向药物应用更加明确和完善。

表2 Her-2/neu蛋白表达、HER-2基因状态与临床病理特征的相关性Tab.2 Association of HER-2/neu protein expression，HER-2 gene status and clinical-pathological characteristics 例

本研究中ER表达与HER-2基因扩增和HER-2/neu蛋白表达负相关，PR表达及ER/PR状态与HER2基因扩增呈负相关，以上相关性均与周国江等［10］和何春燕等［23］的报道一致，提示ER、PR表达阴性者其肿瘤预后较差可能与HER-2基因高表达及扩增率有关。此外，淋巴结转移数量与HER-2基因扩增呈正相关，与要建超等［13］的报道一致。另外，本研究还发现肿瘤大小和组织学分级与HER-2/neu蛋白表达呈正相关，与笔者的报道［4，21］、SHI等［24］及要建超等［13］的报道一致，可能与HER2基因扩增后肿瘤细胞增殖使瘤体增大、组织学分级增高有关。

综上，新旧指南下IHC（-/+）与FISH结果均高度一致，FISH仍是评价IHC（2+/3+）者HER-2基因扩增的标准方法。新指南结合了HER-2/CEP17比值、平均HER-2基因拷贝数、IHC对HER-2状态的影响，并取消了HER-2“可疑状态”的判读标准，提高了FISH检测的阴性率，使临床对患者的靶向用药及预后评估更为准确。由于本研究的具体例数有限，也不排除不同地域、不同年龄及不同种族对结果的影响，相关数据还需大量、长期、多中心的调查及临床疗效的评估，使患者对靶向药物的应用及预后评估更加有效和准确。