3β羟基类固醇脱氢酶1和细胞色素P450 17A1在小鼠下丘脑内的表达

贾俊涛， 李 强， 王 昆， 刘昊东， 海日汗， 范奎奎， 潘 登， 杜晨光,

(1.内蒙古农业大学职业技术学院， 内蒙古包头014109 ； 2.河北省农林科学院粮油作物研究所， 河北石家庄050000 ； 3.内蒙古农业大学兽医学院， 内蒙古呼和浩特010018)

下丘脑作为中枢神经系统内调节内脏活动和内分泌活动的关键中枢，可对能量代谢及各类激素的分泌发挥关键性调节作用[1]。类固醇激素作为激素大家族中的一个分支，亦可在动物体多种生理活动中发挥重要调控作用。例如，雌激素除可作用于生殖泌尿系统外亦可作用于神经系统以及内脏，发挥促进生殖器官和性征的发育、能量代谢和神经系统认知功能的正常等作用。

目前在小鼠等哺乳动物的研究中，鲜有报道研究中枢神经系统内类固醇激素的合成机制以及合成调节因子的表达分布。现有研究仅局限于睾丸、卵巢等性腺组织内类固醇激素的合成及作用[2]。类固醇激素是由多种调节酶经复杂的过程合成的，简言之，即类固醇激素合成系统被激活后，作为合成前体的胆固醇经类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)，从线粒体外膜转移至内膜，后经包括3β羟基类固醇脱氢酶1(3β-HSD1)和细胞色素P450 17A1(CYP17A1)等酶的作用逐步合成类固醇激素[3]。同时研究还发现，2型糖尿病及db/db小鼠模型均表现为类固醇激素含量增加，并且是由于其合成调节因子的表达增多造成的[4]，但并未说明中枢神经系统的调控作用。因此，研究中枢神经系统内类固醇激素的合成机制对治疗潜在的类固醇激素相关疾病将具有重要意义。

本试验以C57BL/6小鼠下丘脑为试验材料，分别使用免疫荧光技术定位3β羟基类固醇脱氢酶1(3β-HSD1)和细胞色素P450 17A1(CYP17A1)免疫阳性荧光信号的分布,并使用Western Blot技术检测3β-HSD1和CYP17A1蛋白在下丘脑内的表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要材料 实验动物：C57BL/6小鼠，购自北京维通利华生物科技有限公司，经自群繁育后，获得适应现有饲养条件的6～8周龄小鼠，最大程度减少环境应激。试验药品：标准驴血清白蛋白 (Jackson，NDS，071-000-121)；柠檬酸钠(Sigma，1064325000)；磷酸盐粉末(福州迈新,0060)；驴血清(Jackson,119842)；一抗：Rabbit Anti-3βHSD1(Abcam,ab65156),Rabbit Anti-CYP17A1 (Abcam,ab125022),GAPDH(Abcam,ab181602)；二抗：Alexa647 Donkey anti-Rabbit (Abcam,ab150075)，Goat-anti-rabbit IgG (Jackson)。试验仪器：恒温孵育仪(Eppendorf ThermoMixerTMC)，灌注泵(SENZ,310D)，冰冻切片机(Lecia,CM1950)，激光共聚焦显微镜(Nikon Confocal C2)，酶标仪(Bio-Tek,Synergy HT)。

1.2 组织获取及处理 用于免疫荧光检测的小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠彻底麻醉后，使用灌注泵(SENZ-210D)经心肺以3.5 mL/min灌注3 min生理盐水共约10 mL，后以5 mL/min灌注固定液(4%多聚甲醛，Sigma,158127，pH 7.4)40 min，共约200 mL， 随后取其脑组织置于相应固定液中固定过夜，修块后转移至30%蔗糖(VETEC,V900116)溶液中4 ℃脱水直至完全沉降。使用OCT包埋剂(SLEE,30001101)包埋后置于冰冻切片机(Lecia,CM1950)对脑组织冠状面进行连续切片，厚度为30 μm， 漂片法洗涤，4 ℃保存，并加入叠氮化钠(NaN3)防腐。

用于Western Blot检测的小鼠，经断颈处死，快速剖取下丘脑组织，冻存于-80 ℃。

1.3 免疫荧光 分别选取不同位置脑组织切片于4 ℃摇床上使用1% Triton(Sigma,T8787)+0.4% SDS(pH 8.70) 80 r/min预处理4 h。3% NDS(Jackson，071-000-121)室温(29 ℃)封闭1 h，4 ℃过夜孵育一抗(3βHSD1，1∶200；CYP17A1，1∶200)、然后室温孵育二抗(Alexa647，1∶2 000) 2 h。每步结束后用PBS清洗3次，每次10 min。然后将切片整齐的贴于载玻片，待其完全干燥后，使用激光共聚焦显微镜于647波段进行扫描。

1.4 Western Blot 从-80 ℃超低温冰箱内取出下丘脑组织，使用裂解液(CWBIO，RIPA Lysis Buffer，01408/60412)进行蛋白提取。蛋白上清液按比例添加蛋白上样缓冲液95 ℃变性10 min，蛋白经5%～12% SDS-PAGE电泳分离，转印至NC膜(PALL，LOTT70983)上，5%脱脂奶粉室温摇床封闭1 h，分别孵育一抗Rabbit-anti (3β-HSD1和CYP17A1，1∶1 000；GAPDH 1∶5 000)4 ℃摇床过夜，二抗Donkey anti-Rabbit IR800 (Jackson,LI-COR926-68022,1∶20 000)，室温摇床孵育2 h。应用蛋白扫描仪成像检测3β-HSD1和CYP17A1在下丘脑内的蛋白表达情况。

2 结果

2.1 3β-HSD1神经元在小鼠下丘脑内的分布 3β-HSD1神经元在小鼠下丘脑内呈广泛性表达，主要表达于下丘脑腹内侧核(VMH)、背外侧核(DMH)、弓状核(ARC)内，见中插彩版图1。

2.2 细胞色素P450 17A1神经元在小鼠下丘脑内的分布 细胞色素P450 17A1神经元在小鼠下丘脑内背外侧核(DMH)和室旁核(PVN)分布，见中插彩版图2。

2.3 蛋白3β-HSD1和CYP17A1在下丘脑的表达 3β-HSD1和CYP17A1在小鼠下丘脑内的蛋白表达情况，见中插彩版图3。

3 讨论

下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)是一个复杂的神经内分泌反馈回路，控制各类激素的分泌，如肾上腺糖皮质激素。其功能的核心是下丘脑室旁核(PVN)，促皮质激素释放因子的神经元表达于此[5]。下丘脑是生物机体内重要的神经内分泌中枢，控制着机体众多生理活动。在下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)中，下丘脑分泌的促肾上腺激素释放激素(CRH)调节腺垂体分泌促性腺激素，卵泡刺激素和黄体生成素，二者又可刺激性腺分泌性激素，如雌二醇(E2)和睾酮(T)，同时性激素又能对下丘脑的激素分泌发挥反馈性调节作用。因此性腺和下丘脑之间存在紧密的功能性联系。同时，内源性类固醇，如雌激素和雄激素，在神经系统中具有多种功能，包括对神经元存活、增殖和突触传递调节的影响。在出生后阶段，哺乳动物的性腺产生3组必需的类固醇激素：孕激素(孕酮P4)、雌激素(雌激素E1和雌二醇E2)和雄激素(雄烯二酮A和睾酮T)。这些代谢产物由类固醇生成途径中的胆固醇产生，通过各种酶的活性合成[6-7]。3β羟基类固醇脱氢酶1(3β-HSD1)和细胞色素P450 17A1(CYP17A1) 在孕酮和睾酮的合成中起重要作用，同时CYP19A1基因的产物亦参与雌激素和雌二醇的合成[8-9]。然而目前鲜有报道研究下丘脑内性类固醇激素合成关键调节因子的表达及相关合成机制，为此本试验针对类固醇激素合成关键调节因子(3β-HSD1和CYP17A1)在下丘脑内的分布进行定位，结果表明，3β-HSD1和CYP17A1在下丘脑内的背外侧核、腹内侧核、室旁核及弓状核内分布，根据以往研究报道猜测上述核团内3β-HSD1和CYP17A1在下丘脑调节激素分泌的过程中发挥关键性调控作用。

3β-HSD1是膜结合酶，根据表达的细胞类型分布于线粒体膜和微粒体膜。在过去的10年中，羟基类固醇脱氢酶的多种亚型已被分离并在人、小鼠和大鼠体内进行了功能性研究[10-11]。3β-HSD1酶控制着类固醇激素生物合成中的关键类固醇生成反应，参与糖皮质激素、矿皮质激素、孕酮、雄激素和雌激素在许多组织中的形成。产后卵巢由卵泡和黄体组成，它们具有特定的功能，并依赖于激素生成酶的差异表达，从而产生选择性的激素[12]。在卵巢发育的早期阶段检测到3β-HSD1，以及睾丸激素的缺失，表明这种酶可能发挥不同的作用，可能参与产后阶段产生类固醇激素的体细胞系。另一方面，对一些可合成睾酮的细胞进行检测表明，3β-HSD1可大量催化其他一些中间代谢物，如孕酮。

细胞色素P450 17A1 (CYP17A1)是人类体内一种极其重要的酶，催化所有内源性雄激素的形成[13]。它是一种非典型的细胞色素P450酶，催化2种不同类型的底物氧化。通过羟化酶活性，催化孕烯醇酮的17α-羟基化反应生成17α-OH孕烯醇酮。随后，通过其C17、C20裂解酶作用，进一步将17α-OH孕烯醇酮转化为雄激素脱氢表雄酮，是雄激素二酮、睾酮、双氢睾酮的前体。通过几十年的研究,目前已证实雄激素在前列腺癌等疾病中的重要性，睾丸外雄激素形成的发现有助于阐明该疾病的病理，特别是抗阉割性疾病[14]。因此，对CYP17A1的特异性抑制已成为一个重要的研究领域。

本试验结果显示，类固醇合成调节因子3β-HSD1和CYP17A1分别在下丘脑内侧核(VMH)、背外侧核(DMH)、弓状核(ARC)以及室旁核(PVN)有阳性神经元分布。据报道，上述下丘脑核团均涉及能量代谢及激素的分泌调节[15-16]。同时，类固醇激素参与机体众多稳态调节，其中包括能量代谢和生殖调控[17-18]。以上结论为研究类固醇激素在下丘脑内的潜在作用提供形态学支持。

4 结论

综上，类固醇激素合成调节因子(3β-HSD1和CYP17A1)在下丘脑关键功能核团的分布，以及其核团的众多调控作用。提示3β-HSD1和CYP17A1参与下丘脑涉及的能量代谢及激素分泌的功能活动中，为进一步研究下丘脑调控类固醇激素的合成及分泌提供了参考数据。