胰高血糖素样多肽-1对肺脏炎症的抑制作用研究进展

白 玉， 赵立红， 连朋敬， 李静云， 乔 健

(中国农业大学动物医学院， 北京海淀100193)

胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)是由胰高血糖素(GCG)基因编码的一种分泌型多肽，具有诱导胰岛素分泌、降血糖、抑制内质网应激、抵抗氧化应激等多种生物学功能。由于GLP-1在体内半衰期极短，易被降解，因此科学家开发出具有较长半衰期的GLP-1多肽分子相似物——胰高血糖素样多肽-1受体激动剂(GLP-1Ra)，并将其作为治疗2型糖尿病(T2DM)的药物，现已上市。GLP-1和GLP-1Ra除用作治疗T2DM外，还具有抑制多种组织器官炎症的作用。本文就GLP-1和GLP-1Ra抑制肺脏炎症作用及其机制的研究进展进行综述，为进一步探讨GLP-1或GLP-1Ra作为抗肺炎药物的研发提供参考依据。

1 胰高血糖素样多肽-1的生物合成及其释放

胰高血糖素样多肽-1(Glucagon like peptide-1，GLP-1)是由胰高血糖素(Glucagon，GCG)基因编码的一种分泌型多肽，早在20世纪80年代科学家已经克隆出GCG基因，并发现其编码多种多肽分子。GCG基因含6个外显子(E1～E6)，它们分别编码肠高血糖素相关胰腺多肽(Glicentin-related pancreatic polypeptide，GRPP)、胰高血糖素(GCG)、GLP-1、胰高血糖素样多肽-2(Glucagon like peptide-2，GLP-2)以及信号肽等不同种类的多肽分子[1]。GCG基因被翻译成多种不同多肽分子的过程为：首先GCG基因在细胞核内转录GCGmRNA，后者通过核孔进入细胞质中，在核糖体上以GCGmRNA为模板翻译出长度为180个氨基酸的胰高血糖素原(Proglucagon)[2]，胰高血糖素原在不同器官或细胞中被激素原转化酶(Prohormone convertase，PC)切割成不同的多肽分子后，再分泌到细胞外，其中，在胰腺内胰高血糖素原被激素原转化酶2(PC 2)切割成GRPP和GCG再分泌到胞外，在中枢神经系统和肠道中胰高血糖素原被激素原转化酶1/3(PC 1/3)切割成胃泌酸调节素(Oxyntomodulin)、GLP-1和GLP-2，在胞质中GLP-1的C端或N端进一步分别被切割掉6个或1个氨基酸后形成有活性的GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)形式再被分泌到胞外，有活性的GLP-1与胰高血糖素样多肽-1受体(Glucagon like peptide-1 receptor，GLP-1R)结合激活下游细胞信号通路，从而行使生物学功能[3]。

2 胰高血糖素样多肽-1的结构组成及其主要生物学功能

GLP-1是由37个氨基酸组成的多肽分子(中插彩版图1A)，GLP-1的第1～6位或第37位氨基酸被酶切掉修饰生成2种活性形式，即GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)，其中前者是体内存在的主要形式。当活性形式的GLP-1与受体结合并激活下游通路后，其第1～2位氨基酸(GLP-1全长的第7～8位氨基酸)被酶切掉修饰成无活性的GLP-1，即GLP-1(9-36)和GLP-1(9-37)。由于GLP-1(7-36)仅由30个多氨基酸组成，其天然构象虽然仅为连续的α-螺旋结构(中插彩版图1B)，但具有多种生物学功能，是生命过程中不可缺少的一种激素。

胰高血糖素多肽-1受体(GLP-1R)是一种七跨膜α-螺旋结构的B类G蛋白偶联受体(B-GPCR)[4]，其氨基酸序列的N端位于细胞膜外侧，有6个半胱氨酸位于N末端，其与配体的结合有密切关系，N端氨基酸序列被糖基化修饰后使GLP-1R结构稳定；其氨基酸序列的C端位于细胞膜内侧，与α、β和γ亚基三聚体结构的G蛋白组成GLP-1R-Gs复合体[2]。静息状态时，GLP-1R-Gs复合体中的G蛋白与GDP结合，当活性形式GLP-1与GLP-1R的N端结合后，GLP-1R被激活，在Mg2+参与下，诱导与G蛋白结合的GDP与胞质中GTP交换形成GTP-αβγ结构，然后GTP-α与βγ分离，游离的GTP-α激活胞膜上的腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase，AC)，AC催化腺苷酸环化生成第二信使cAMP并变构激活蛋白激酶(Protein kinase，PK)A，活化后的PKA激活丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)、CHOP等功能蛋白发挥相应生物学功能[5]；与此同时，GLP-1被酶切割成无活性形式并与GLP-1R分离，而α亚单位本身具有GTP水解酶活性，促使GTP-α释放Pi形成GDP-α，后者再与βγ亚单位形成GDP-αβγ形式而恢复到静息状态[2]。

GLP-1(7-36)与GLP-1R互作后通过cAMP信号通路激活PKA和Gadd34蛋白以减弱内质网应激反应。有研究表明，GLP-1(7-36)通过高表达Bcl-2蛋白降低机体在病理情况下细胞凋亡数量[6]。有资料显示，GLP-1(7-36)能有效提高血管内皮细胞活性和减少活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的产生，在机体内还能修复受损的血管内皮结构保证血管的完整性[7]。核因子(Nuclear factor，NF)-κB能调控细胞因子和趋化因子等多种蛋白质的表达，GLP-1(7-36)与GLP-1R互作后通过激活PI3K/Akt信号通路抑制NF-κB的磷酸化，细胞内低表达磷酸化NF-κB会降低促炎因子的表达，最终抑制炎症反应。Epac2蛋白是调控胰岛素分泌的关键蛋白，在胰岛β细胞中GLP-1(7-36)通过调节Epac2蛋白活性促进胰岛素分泌。

3 GLP-1和GLP-1Ra与肺脏炎症

近些年科学家相继发现，GLP-1(7-36)能够抑制多种组织器官的炎症，尤其对呼吸系统炎症的抑制作用更加明显，故GLP-1有望被开发成为一种抑制肺脏炎症的靶向药物[8]。因GLP-1(7-36)在体内能被血管内皮上的二肽酰肽酶-Ⅳ(Dipeptidylpeptidase-Ⅳ，DPP-Ⅳ)很快降解并失去其生物学功能，导致GLP-1在体内的半衰期不超过2 min；因此，科学家运用现代分子生物学手段制备出与GLP-1(7-36)具有高度同源性且生物学功能相近的GLP-1Ra，其中同源性最高且在科学研究和临床中最常用的是利拉鲁肽，其34位点由赖氨酸取代精氨酸，并通过谷氨酸间隔子在第26位赖氨酸上增加了1个16-碳棕榈酰脂肪酸侧链，这些改变不仅降低其被DPP-Ⅳ的降解作用，还增强了与受体的亲和力[1]。GLP-1Ra同样可与GLP-1R结合激活相同的下游通路，且GLP-1Ra的体内半衰期明显延长，可长达13 h。有研究发现,小鼠肺脏中GLP-1R表达量显著高于脑、肠道和肾脏等器官[9]，结果提示,GLP-1R可能是治疗肺炎等肺脏疾病的重要靶点之一。

3.1 GLP-1和GLP-1Ra与非感染性肺炎 运用低剂量卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)长期持续刺激小鼠呼吸道能够诱导小鼠发生非感染性肺炎，有学者对OVA诱导的肺炎病理模型小鼠多次注射利拉鲁肽后，经病理组织学检查发现，注射利拉鲁肽小鼠肺炎发病程度、呼吸道内黏液分泌量明显减少，以及肺泡灌洗液中细胞数量和蛋白质浓度均低于未注射利拉鲁肽小鼠，上述结果表明，利拉鲁肽可有效减轻肺炎发病程度并制止肺泡的炎性渗出。OVA主要通过高表达磷酸化NF-κB诱导肺炎的发生，Western Blot检测发现给OVA诱导的肺炎小鼠注射利拉鲁肽后，其肺脏中磷酸化NF-κB表达量较未注射小鼠明显降低；运用H-89(PKA抑制剂)处理OVA诱导的肺炎小鼠模型后，利拉鲁肽抑制肺脏炎症的作用减弱，磷酸化NF-κB表达量较未用H-89组明显增加，该结果进一步证明，利拉鲁肽是通过PKA/NF-κB途径抑制OVA诱导的非炎症性肺炎[5]。运用适宜浓度的OVA加LPS多次吸入式刺激雌性小鼠可诱导雌性小鼠发生慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，再对该病理模型小鼠多次注射利拉鲁肽，结果发现，在刺激后第21天时注射利拉鲁肽小鼠未见小鼠死亡，而未注射利拉鲁肽小鼠死亡率高于50%，表明利拉鲁肽能有效降低因COPD引起的小鼠死亡风险[9]。静态肺功能指数是衡量肺脏功能的重要指标之一，静态肺功能指数越小，表明肺脏功能越好，对COPD模型小鼠注射利拉鲁肽后，测定小鼠静态肺功能指数发现，注射利拉鲁肽小鼠静态肺功能指数明显小于未注射小鼠，此结果说明利拉鲁肽能提高小鼠静态肺功能，病理组织学检查发现,注射利拉鲁肽小鼠肺脏炎症的发病程度明显低于未注射利拉鲁肽小鼠，主要表现为注射利拉鲁肽小鼠的肺泡中炎性细胞数量和蛋白渗出量明显少于未注射小鼠[9]。动物患肺炎时，其肺泡灌洗液和肺脏中细胞因子和趋化因子分泌量明显增多，给肺炎小鼠多次注射GP-1Ra后，IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量明显减少，说明GLP-1Ra可有效抑制肺炎发生时细胞因子的生物合成[10]。巨噬细胞在肺脏炎症的发病过程中扮演重要角色，巨噬细胞被刺激后能够分化成为Ⅰ型和Ⅱ型巨噬细胞，其中Ⅰ型巨噬细胞分泌促炎因子，如IL-1β和TNF-α等；而Ⅱ型巨噬细胞分泌抑炎因子，如IL-10等，肺炎时肺脏固有巨噬细胞和肺泡巨噬细胞均表现为Ⅰ型表型并分泌大量促炎因子，加重肺炎发病程度以及伴有严重的急性肺损伤。有研究发现，GLP-1能诱导人巨噬细胞表型转化，即从Ⅰ型表型转化为Ⅱ型表型以及分泌抑炎因子—IL-10 等，并且在0.5～30 nmol/L浓度范围内，GLP-1对巨噬细胞表型转化呈现剂量依赖性特点，但抑制STAT3磷酸化后，GLP-1诱导巨噬细胞表型转化的生物学功能将减退或消失，此结果说明GLP-1通过p-STAT3通路将Ⅰ型巨噬细胞转化为Ⅱ型巨噬细胞[11]，由此推断GLP-1可能通过将Ⅰ型巨噬细胞转化为Ⅱ型巨噬细胞从而发挥抑制肺脏炎症的作用。肺部血管内皮细胞的氧化损伤往往可诱导急性肺损伤的发生，而急性肺损伤多伴有严重肺脏炎症的发生，GLP-1Ra能减弱血管内皮细胞氧化应激损伤以及保持血管内皮细胞活力，最终使肺脏炎症也随之减轻[3]。

3.2 GLP-1和GLP-1Ra与感染性肺炎 呼吸合胞体病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)能诱导小鼠肺部发生Ⅱ型变态反应以及IL-13和IL-33等细胞因子大量分泌，有研究者运用9×105PFU数量的RSV感染BALB/c小鼠后，能够诱导小鼠发生明显的Ⅱ型变态反应，再对感染小鼠持续多天注射利拉鲁肽后发现，其肺泡灌洗液中不但细胞总数、CD4+T淋巴细胞、IL-13+ILC2细胞及IL-33+嗜碱性粒细胞数量比未注射利拉鲁肽小鼠明显减少，而且IL-13和IL-33分泌量也明显降低，糖原染色试验发现，注射利拉鲁肽小鼠的呼吸道中黏液分泌量也明显降低，但病毒载量和IFN分泌量未见明显变化，此结果提示利拉鲁肽能减轻RSV诱导的小鼠肺脏Ⅱ型变态反应[12]，此研究首次报告GLP-1Ra能抑制病毒引起的肺脏炎症，但其抑制炎症的分子机制迄今没有阐述。链格孢菌感染小鼠后能引起小鼠肺脏中IL-33、IL-5、IL-13、CCL11、CCL17等细胞因子和趋化因子大量释放以及肺泡灌洗液中ILC2细胞、嗜酸性粒细胞以及CD45-EpCAM+肺上皮细胞数量增多，对链格孢菌感染小鼠连续多次注射利拉鲁肽后发现，小鼠肺泡灌洗液中CD45-EpCAM+肺上皮细胞、ILC2细胞总数、IL-5+ILC2细胞数以及IL-13+ILC2细胞数比未注射利拉鲁肽小鼠均明显减少(P<0.05)，与此同时，IL-13、IL-5、IL-9以及CCL-22等细胞因子和趋化因子均明显减少(P<0.05)，上述试验结果均表明，利拉鲁肽能有效减轻链格孢菌引起的肺脏炎症反应[8,13]。当病原微生物侵入肺脏后，模式识别受体识别病原微生物并激活NF-κB信号通路而诱导天然免疫反应，引起大量细胞因子和趋化因子的释放，对肺炎小鼠注射GLP-1Ra后，GLP-1Ra能够与细胞膜表面的GLP-1R结合并通过PI3K/Akt信号通路抑制NF-κB的磷酸化以减少细胞因子和趋化因子的产生，从而缓解或抑制肺炎发生[6,14]。内质网应激是由于内质网中钙离子紊乱和蛋白质不能正确折叠，导致细胞内质网腔内环境稳态失衡，从而使其生理功能紊乱的过程。病毒侵入宿主后能够诱导宿主细胞发生内质网应激以抵抗病毒的复制，与此同时，内质网应激能引起宿主发生强烈的炎症反应，而GLP-1或GLP-1Ra可通过PKA/Gadd34通路降低内质网应激的反应强度并抑制eIF2α的磷酸化，从而减少促炎因子基因的转录和翻译，最终降低或抑制宿主的炎症反应[15]。细菌、病毒或支原体等生物性因素感染宿主肺脏后因其能够破坏细胞结构，引起宿主肺脏细胞氧化—抗氧化平衡被打破而产生大量ROS，其结果是诱导宿主发生不同程度的肺损伤和炎症反应，而GLP-1和GLP-1Ra能显著降低细胞氧化应激水平以减弱由病毒、细菌或支原体引起的肺损伤或肺炎等[6]。

4 小结与展望

GLP-1或GLP-1Ra与GLP-1R结合后通过激活下游PI3K/Akt信号通路抑制NF-κB磷酸化，进而使多种细胞因子和趋化因子表达降低以减轻肺脏炎症反应。GLP-1或GLP-1Ra还能通过降低肺脏内质网应激和恢复氧化—抗氧化系统平衡抑制肺脏炎症反应。GLP-1Ra如利拉鲁肽、安塞多肽等通过化学修饰后，其分子结构和理化性状等比GLP-1更加稳定，且不易被降解。目前，GLP-1Ra—利拉鲁肽作为治疗T2DM药物已经上市，且效果较好。由于其还具有抗炎作用，尤其对长期慢性炎症具有良好的抑制效果，而肺脏中GLP-1R表达量均高于其他器官，所以GLP-1Ra有望被开发成为一种抗肺炎药物。但目前仍有多个问题有待进一步深入探讨，如：GLP-1Ra生产成本较高；较大剂量的GLP-1Ra作用中枢神经系统后能抑制食欲，使体重减轻[8]；长期较大剂量使用GLP-1Ra可造成低血糖症[1]；对GLP-1和GLP-1Ra抗炎作用的机制仍不是十分清楚，而可供临床研究的案例少之又少，所以对GLP-1和GLP-1Ra作用机制的深入探究带来不便。但随着生命科学的不断发展，以上科学问题定会被彻底解决，并为其作为抗肺炎药物的研发提供依据。