大动物多能干细胞建立研究进展

才文道力玛伊敏娜王希生神英超纳日嘎陶力格日乐其木格芒来∗

(1.内蒙古农业大学动物科学学院,内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖学重点实验室,呼和浩特 010018;2.农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站,内蒙古农业大学马属动物研究中心,呼和浩特 010018)

多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)是一类能高度分化,具有体外无限自我更新和自我增殖,并且能够分化成三胚层多种细胞类型的一类干细胞。PSCs可以起源于胚胎,生殖细胞或体细胞,并且处于不同的多能性状态:原始态(Naïve)和始发态(Primed)。PSCs向外胚谱系(如原始内胚层和滋养外胚层)的分化能力虽然在干细胞领域的科学家中仍存在争议,但是其广泛地分化能力使多能性细胞系成为了研究哺乳动物发育生物学的重要工具,并使它们在移植细胞进行治疗的再生医学中具有巨大的应用前景。目前为止,虽然PSCs的研究主要集中在小鼠和人细胞模型上,然而,由于存在人类干细胞使用相关严格的规定及伦理上的限制,导致许多干细胞应用在临床试验之前必须进行动物实验,这一点要求相关动物模型的积极开发。而啮齿类动物,尤其是小鼠虽然是生物医学研究领域最经典的模式动物,但由于其个体大小、寿命和生理特性方面与人类及其他大动物的差别过于显著,使得其在很大一部分疾病中无法很好地模拟人类或者大动物的状况,促使着研究者们致力于开发更多样化的动物模型。其中马、猪等大型哺乳动物不仅在解剖学、生理学和遗传学上与人类有许多相似之处,还允许复杂的实验,以测试来源于PSCs的移植物的适用性、安全性和有效性等。其次,在农业经济方面PSCs还可以应用于开发转基因动物,其目的就是将新的或修饰的基因整合到其基因组中来改变动物及其后代的特征[1]。如修饰生长激素的表达从而提高猪肉品质;敲出某些蛋白或基因生产出具有乳腺炎抗性的牛等。另外,PSCs基本上是不断增殖的,如果得到适当的保存与维持,它们具有很高的遗传稳定性,这使它们对保护稀有品种和物种,对产生可存活的卵母细胞和精子,从而实现体外受精(in vitro fertilization,IVF)和后代的产生也具有价值。此外,在兽医临床和人类医疗临床前实验等方面它们还可以为检测药物、潜在毒素和致畸物以及内分泌干扰物对发育的影响,甚至细胞移植提供实验室材料[2]。也有学者对这些PSCs的另一种潜在用途,分化为骨骼肌,用于生产肉制品或移植组织等也抱有很大希望[1]。简而言之,干细胞生物学的进步,结合生产转基因动物的有效方法以及我们对大型动物模型价值的日益了解,有望为临床研究治疗及动物生产上的应用提供更多的资源并大大加速人类医学及经济发展。

1 大动物ESCs的建立

1981年,胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是英国剑桥大学Evans等[3]首次通过体外培养从小鼠囊胚期胚胎的内部细胞群分离出来的具有多能性的细胞类型,其特征是呈现圆顶克隆,单细胞存活率高,依赖JAK/STAT信号,表达与糖酵解、脂质、囊泡生物学和代谢相关的基因。它具有无限增长,并且能够分化为所有三个胚层细胞的能力。当被注射到植入前胚胎中时,可以形成嵌合体,并参与生殖细胞的发育[4],在雌性中包含重新激活的X染色体,并在多能性方面显示出高度的同质性。尽管不同克隆的增殖效率不同,但是小鼠胚胎干细胞通常是在含有白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF)和ERK/MAPK信号抑制剂的培养基中增殖的,例如CHIR99021和PD0325901(也称为2i条件)。确定ESC系多能性的常用方法有干细胞相关基因和表面标志物的表达、在体外形成胚状体的能力以及其分化为代表三个胚层的特定细胞类型的能力、在动物体内多向分化的潜能,如移植到免疫缺陷动物体内是否可以形成畸胎瘤并含有三个胚层的组织和来源物种体内嵌合后代的产生、最高级别的黄金标准还有四倍体嵌合实验。而至今为止,从植入前的胚胎中建立的小鼠ESCs是满足所有这些多能性测量标准的唯一细胞类型。而与小鼠ESCs相比,猪、牛、马等大动物的ESC细胞系的建立和研究进展滞后很多,以下分别做概述。

1.1 猪胚胎干细胞

啮齿类动物小鼠因易饲养、妊娠期短等优势已成为医学研究最常见的哺乳动物模型,但是它无法很好地模拟一些人类疾病。而猪由于其寿命、器官大小和生理特性与人类相似,对于研究某些人类遗传疾病和异种器官移植方面比起其他大型动物更具有优势[5]。目前猪胚胎干细胞可以从体外胚胎、孤雌激活和核移植等方法建立[6-7]。这些细胞通常以扁平的多边形上皮样细胞在体外增殖,它具有碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)活性,可以在体外培养物中维持较长时间并形成胚状体,但仅分化为有限数量的细胞类型。同时,他们还显示了包括OCT4、NANOG、SOX2和SSEA-1等多能性标记物的表达[8-10],可其中只有2011年Telugu等[10]通过上调KLF4和POU5F1的表达,从猪胚泡内部细胞团中获得的白血病抑制因子依赖性类似naïve型多能干细胞在免疫缺陷小鼠体内产生了畸胎瘤。而且除了少数[9],能促成嵌合体但未观察到种系传播的细胞系外,他们中的大多数并不能促成嵌合体。与小鼠和人类相比,猪的植入前发育期延长,导致很难确定导出ESC的最佳胚胎阶段,也无法确定衍生和维持这些细胞的理想培养条件。迄今为止,仍然没有满足所有体内多能性标准,包括嵌合体产生以及种系贡献的猪胚泡来源胚胎干细胞系。

1.2 牛胚胎干细胞

奶牛因其生殖周期的相似性,成为研究女性卵巢功能、衰老对生育力的影响以及某些子宫疾病的重要动物模型[11]。通过基因选择或基因编辑来生产具有遗传优势的牛可以有效减少奶牛乳房炎等疾病,从而提高奶制品和肉制品的营养价值改善人类健康,因此牛胚胎干细胞系的建立对生物医学和农学应用都具有巨大的价值。已有许多方法产生牛胚胎干细胞系,如体外胚胎生产[12-14]、孤雌生殖激活[15]以及体细胞核移植法(somatic cell nucleus transplantation,SCNT)[14]等,这些牛ESC样细胞系,具有高的AP活性,并表达了OCT4、SOX2、NANOG、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81等多能性标记物,并且有些可以形成畸胎瘤[13-14]。虽然人们在改善培养基等方面做了许多工作,但由于收集胚胎较难及没有合适的体外培养系统等问题,尚未有报道关于可产生种系嵌合体的牛胚胎干细胞系。

1.3 马胚胎干细胞

马作为重要的运动动物,被认为是测试肌肉骨骼损伤,如软骨损伤或退化细胞疗法的理想动物模型,因为其承重肌腱结构和基质组成以及关节和肌腱损伤的性质与人类非常相似,因此对于同种异体肌腱细胞移植方面具有潜在应用价值[15]。很多研究集中在马ESC分化为肌腱细胞和分化衍生物的免疫原性中,关于建立马胚胎干细胞的报道寥寥无几。在马匹中,最初Saito等[16]描述了从脐带来源的牛成纤维细胞饲养层上培养的冷冻和解冻的胚泡中分离出的具有正常核型的马ESC样细胞,这些细胞系维持超过50代并表达了多能性标记SSEA-1、STAT3、OCT4和碱性磷酸酶以及体外分化为神经祖细胞和造血或内皮细胞谱系的能力。之后分别有两个小组[17-18]报道了从内细胞团(inner cell mass,ICM)建立的马ESC样细胞,并在补充LIF的培养基中维持培养20代以上。后者发现马ESC样细胞具有干细胞特异性基因的独特表达特征,与人和小鼠的ESC不同,从马胚胎中分离的ES样细胞表达了OCT4、AP、SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。小鼠ESC仅表达SSEA-1,人类ESC则表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81,不表达SSEA-1。这些所获得的细胞它们的形态类似典型上皮样,并能够分化为所有三个胚层,但是当被注入裸鼠时既没有形成畸胎瘤,也没有检测到嵌合体的产生。另外,2011年的一项研究使用了克隆的和孤雌性激活的胚泡进行马ESC系的分离[19]。然而,由于该物种卵母细胞和胚胎的缺乏以及其体外胚胎生产系统的缺乏,马胚胎干细胞的分离受到阻碍,因此关于马胚胎干细胞系的描述还很模糊,有关研究也很有限。

以上对三类家养物种ESC的现状总结表明,建立稳定的家畜胚胎干细胞仍然是个问题,因此使用重编程的体细胞提供了一个很好的选择。2006年,诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)是由Takahashi等[20]通过采用导入外源基因的方法使体细胞发生重编程而获得的,可以无限增殖更新并具有分化为各种组织细胞潜能的一类干细胞系。他们证明了四种关键转录因子OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC(Yamanaka因子或OSKM)的诱导表达能够将小鼠体细胞重新编程成与ESC细胞具有相似多潜能特征的细胞。它们可以由任何类型的细胞产生,因此可以选择供体的表型,而不会造成使用ESC所产生的伦理困境。从那以后,人们做了很多努力来获取和鉴定家畜的iPSC细胞。以助于填补实验室动物(尤其是小鼠)实验和人类临床实验之间的巨大差距,并作为比啮齿动物更准确的研究人类疾病的模型,为测试iPSCs安全性和潜力提供宝贵系统[21]。

2 大动物iPSCs的建立

2.1 猪诱导多能干细胞

相比于牛和马,猪的诱导多能干细胞研究开展的较早。早在2009年就有三个小组发文声称成功利用Yamanaka四因子从猪成纤维细胞产生猪iPS细胞系[22-24]。次年,美国密苏里州密苏里大学通过慢病毒载体使用重编程因子Oct4、Sox2、KIf4、c-Myc、Nanog和Lin28从猪骨髓源间充质干细胞产生猪iPS系,并首次证明了猪iPS能够形成对所有3个胚层,滋养外胚层和性腺都起作用的嵌合体,且能繁殖活后代[25]。他们将iPSCs显微注射到胚泡期的猪胚胎中生产出了能适应种系的嵌合家畜,但是在该研究中生产的29个嵌合动物中的种系传播率低(4.7%);在生产的两只Oct4和Nanog转基因阳性F1仔猪中,一只为死胎,而其同窝其他仔猪只存活了3 d。随后,在2011年有研究报道[26]首次从猪iPS细胞系衍生功能性细胞,即成功诱导猪iPS细胞系,并将piPSC在补充抗坏血酸的分化培养基中培养15 d后,该细胞系自发产生了跳动的心肌样细胞,其通过免疫荧光分析表达GATA4、SMA和vimentin显示出类似于心肌细胞的特征。诱导多能干细胞虽然不涉及伦理道德等问题,但存在技术方面的困难,如病毒载体随机整合到宿主基因组中,可能会破坏肿瘤抑制基因,激活癌基因或破坏必需基因的危险性,因此尽管病毒介导的转染非常有效且易于使用,人们仍在努力开发其他方法来诱导猪iPS细胞系,如减少或替代转录因子[27-28]、非病毒转染法[29-30]、microRNA诱导[31]等。此外也有研究团队致力于提高piPSC产生效率的研究中,如培养条件的改善[32-35]、宿主细胞的选择[35]。这些研究中产生的猪iPS细胞表达多能性基因OCT3/4和SOX2并且可以在体外和体内分化为三胚层的细胞[23-24,27-28,33-34],而其中的部分细胞对于SSEA-3、SSEA-4、TAR-1-60和TAR-1-81的表达呈阳性[24,27],部分却呈阴性[23,30]。另外,它们还可以诱导产生神经元[32]和软骨细胞[30]。

2.2 牛诱导多能干细胞

通过逆转录病毒载体和多启动子质粒方法从牛成纤维细胞产生牛iPS细胞系,正式开启了牛iPS细胞相关研究的道路[36-38]。分别使用了6个转录因子(transcription factor,TF)(Oct4、Sox2、KIf4、c-Myc、Nanog和Lin28)、Yamanaka 4TF(Oct4、Sox2、KIf4、c-Myc)以及4TF﹢Nanog的组合。其中使用6TF和5TF的小组明确指出了4TF产生的克隆不能传代至第6代或第8代以上,而另一个小组并没有明确说明,也许这一差别出自前者使用了逆转录病毒载体,而后者则使用了多启动子质粒方法。同时,研究表明,血清替代物(knockout serum replacement,KSR)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,BFGF)最有利于biPS的产生[36];牛iPS细胞对MEK,GSK3β及其各自信号通路的成分具有依赖性[37];以及将NANOG添加到逆转录病毒诱导混合物中对于biPS的产生至关重要[38]。次年,首次报道了牛iPS细胞在使用猪卵泡液和RA诱导分化的特定培养条件下,P12代biPS细胞被诱导为雌性生殖细胞并表达早期和晚期雌性生殖细胞特异性基因Vasa、Dazl、Gdf9、Zp2和Zp3,并观察到多个卵母细胞样细胞和滤泡样结构,免疫荧光染色显示,生殖细胞特异性标记Vasa和Nobox在卵母细胞样细胞中呈阳性[39]。另外,这项研究所产生的牛iPS细胞对于SSEA-1的表达呈阳性,对SSEA-3、SSEA-4、TAR-1-60和、TAR-1-81的表达呈阴性,刚好与Huang等[37]的研究结果相反。同年,广西大学石德顺研究员等[40]提出,SV40大T抗原可降低p53的表达并提高biPSC重编程的效率,或者在重编程的早期使用p53抑制剂PFT(p-fifty three)抑制p53的表达可以促进biPSC的重编程的理论。随后,在2015年Talluri等[41]和Kawaguchi等[41-42]通过piggyBac转座子方法使用4TF分别从牛成纤维细胞和羊膜细胞成功产生了牛iPS细胞。Talluri等[41]是将两种转座子(sleeping beauty,SB和piggy bac,PB)进行比较,并表示相比于SB系统PB更适合BEF的重编程。Kawaguchi等[42]则是从羊膜细胞建立了两种类型的牛iPS细胞,并首次证明了牛iPS细胞可以促进嵌合胎儿并分化为所有组织,包括胚外组织。在去年,Rawat等[43]为提高牛胚胎成纤维细胞(bovine embryonic fibroblast,BEF)重编程效率进行了不同的时间更换培养基来确定重编程效率的研究,并表示在第5天更换培养基,克隆形成率最高。而Pillai等[44]是将人和鼠类中可提高重编程效率的方法用在牛iPS诱导实验中,如通过敲低MBD3,Trp53/TP53和过表达BRD3R和多能性相关microRNA 302/367簇,结果显示这些方法在牛中都不能有效改善重编程效率。而使用牛基因对牛细胞进行重编程可能会导致某种程度的效率提高;且胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)中的某些成分对于增强牛细胞的重编程效率可能至关重要。这些牛iPS细胞可以在体外和体内分化为三胚层的细胞[36-40],并且表达多能性相关基因NANOG和SSEA-1,个别除外[37]。

2.3 马诱导多能干细胞

马iPS细胞系的研究始于2011年Nagy等[45]的一篇文章,即基于piggyBac转座子的方法用重编程因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc从妊娠55 d马胎儿成纤维细胞中生成iPS细胞。其建立的马iPS细胞系表达标志性多能性标记Nanog、SSEA1、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81,即使在长期培养期间也显示出稳定的核型,并且在体内移植到免疫功能低下的小鼠中后容易形成包含所有三个胚芽层衍生组织的复杂畸胎瘤,虽然注射的小鼠暂时接受了强力霉素的喂养之后维持重编程转基因的表达,但仍表明获得的细胞具有体内分化能力。随后,澳大利亚科学家通过逆转录病毒利用三因子(Oct4、Sox2和Klf4)将成年马成纤维细胞重编程为iPS细胞,并首次证明了不含原癌基因c-Myc,一样可以从马胚胎成纤维细胞(equine embryonic fobroblast,EEF)产生iPS细胞系,此研究为软骨和腱损伤模型中的自体移植打开了大门[46]。2013年,英国爱丁堡大学的科研人员首次报道,马iPS细胞系在适当的条件下,可以分化为具有运动神经元样特性的电活性细胞,产生的细胞具有胆碱能运动神经元的特征,包括能够产生动作电位的能力,并且发现马iPS细胞表达多能干细胞标记Dnmt3B[47]。另外,此文和同年发布的另一篇文章都表示,马iPS细胞系的自我更新对LIF具有依赖性[47-48]。2018年,有研究团队首次对马iPS细胞系进行了MicroRNA分析,结果显示与成纤维细胞相比,E-iPS中MicroRNA的表达水平与人类的较为相似[49]。因诱导多能干细胞可以从不同类型的细胞产生,Pessôa等[50]通过慢病毒系统使用人4TF分别从成年马成纤维细胞(eFibros)和骨髓间充质细胞(eBMmsc),脂肪组织间充质细胞(eADmsc)和脐带组织间充质细胞(eUCmsc)生成马iPS细胞。结果表明,eBMmsc无法生成E-iPSC。产生的所有马iPS细胞都表达多能性相关基因OCT3/4和NANOG,而且部分可以在体外和体内分化为三胚层的细胞[46-48]。

3 结语

现如今,大型哺乳动物胚胎干细胞和诱导多能干细胞的建立在产生转基因动物以及再生医学领域提供了巨大的应用潜力,如遗传疾病的研究、安全性的测试、异种移植物的来源、优秀性状动物繁殖等。然而,胚胎干细胞因涉及到胚胎及其它的收集难度、衍生物的分化潜能,使得无法建立稳定的家畜胚胎干细胞系。这一局面虽然已被诱导多能干细胞的出现打破了,但是由于物种差异和大型哺乳动物多能性的定义等难题,还尚未报道可通过四倍体嵌合实验这一黄金标准的大型哺乳动物多能干细胞。目前,研究人员们在啮齿类和灵长类哺乳动物naïve或primed多能性状态的基因网络、两个状态维持和培养条件、甚至对体内胚胎生长发育及分化机理的深入研究都将对建立和优化及鉴定其他大型哺乳动物胚胎干细胞和诱导多能干细胞提供新思路和方法[51]。作者认为,参考其他哺乳动物研究结果深入了解细胞不同多能性状态内外因素的基础上,结合所关注大型哺乳动物胚胎生长发育特点,对可能关键因素的充分验证和试验是突破研究现状的关键。幸运的是,已有越来越多的研究人员致力于家畜多能干细胞系的建立工作中,相信会在不久的将来这些问题都会逐步得到解决。