盆腔脏器脱垂动物模型的建立与适用性评价

严晓,覃彩芳,李青先,秦玲,许文娟,樊伯珍

(上海中医药大学附属普陀医院妇产科,上海 200062)

盆腔脏器脱垂(pelvic organ prolapse,POP)在中老年女性中常见,除排尿等障碍及局部溃疡感染严重外很少会导致患者死亡,但显著影响女性的生活质量。它是一个病程长、治疗及研究等方面具有复杂性的疾病。文献认为阴道分娩、绝经、年老、肥胖等均是POP发生的高危因素[1-2],但相关发病机理的基础研究及各种临床治疗效果的病理生理机制仍不清,这些基础研究及探讨离不开稳定的动物模型的建立。因此,如何制作合适的POP动物模型对于加深对其病因学和进展的认识以及研究有效的预防和治疗策略有重要意义。本研究通过模拟妊娠难产产生的脏器支撑组织损伤和模拟绝经制备POP大鼠模型,并结合文献试图通过对模型大鼠生殖器表型,阴道前壁及子宫骶韧带组织中胶原蛋白含量变化的观察,来初步探讨POP疾病动物模型制作的动物选择、制作的动物模型的适用性以及研究中存在的问题,为不断完善POP疾病动物模型制作提供研究积累。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

6月龄SPF级雌性成年SD大鼠60只,体重约300 g,均已连续分娩过3次,另取同级别同龄无生育SD大鼠为对照,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供【SCXK(沪)2017-0005】,饲养于沪北实验动物中心【SYXK(沪)2018-0034】。饲养环境:昼夜各半循环照明,湿度50%～60%,温度控制在21～24℃。所有操作均符合实验伦理学要求(批号:TJHBLAC-2019-026)。

1.1.2 试剂与仪器

RNA抽提试剂盒,美国zym公司生产。裂解液、逆转录试剂盒、荧光定量聚合酶链反应试剂盒,日本TaKaRa株式会社生产。离心机(Thermo,美国),PCR基因扩增仪(Bio-Rad,美国),实时PCR扩增仪(Applied Biosysterms,美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制备

根据参考文献进行造模[3-5]。取无生育史的45只成年SD雌性大鼠采用随机数字表法分为3组,每组各15只。A组为正常空白对照组,自由进食饮水饲养12周;B组为模拟绝经组,入组后常规饲养2周后单纯双侧卵巢切除,术后饲养10周;C组为模拟产伤及绝经组,入组时即将大鼠腹腔注射麻醉,取俯卧位固定,将6F弗莱氏导尿管插入阴道中约3 cm,并往气囊中注入生理盐水3 mL撑开阴道,用1-0号丝线将导尿管八字缝合于阴道口,将大鼠固定,取耻骨联合位于桌缘使导尿管下垂,给300 g拉力维持4 h后取出,常规饲养2周后行双侧卵巢切除,术后常规饲养10周;D组为增加模拟产伤强度组,取与上述各组入组研究时同龄的15只已连续分娩过3次的SD大鼠,同C组模拟产伤操作1次后间隔2周再行上述操作1次,常规饲养2周后行双卵巢切除术,常规饲养8周。

1.2.2 标本采集及处理

各组随机取8只,测量观察各组大鼠实验前后外阴表现和生殖道裂孔直径的差异,并采用颈椎脱臼法将大鼠处死后,仰卧固定,打开盆腹腔,取出阴道前壁组织置于4%多聚甲醛溶液内固定48 h,脱水,石蜡包埋,待切片;取出大鼠骶韧带组织,置于液氮内备用。

1.2.3 阴道前壁组织COL1A1,COL3A1,TGFβ-3表达水平的检测

免疫组化方法检测:常规固定,脱水,脱蜡后,以免疫组化法检测阴道前壁组织中COL1A1,COL3A1,TGFβ-3的表达。大鼠阴道前壁组织切片脱蜡,水化后,枸橼酸盐缓冲液热修复抗原,加入抗COL1A1,COL3A1,TGFβ-3一抗(1∶100),4℃湿盒内孵育过夜。PBS缓冲液冲洗3次,每次5 min后,加入二抗孵育,显色,复染后,以显微镜观察染色情况,拍摄图片,HIS模式下,选取棕色或棕褐色阳性表达区域,以Image pro plus 6.0图像分析系统计算积分光密度,每张切片取5个视野的光密度的平均值作为该切片的积分光密度值。

1.2.4 骶韧带组织COL1A1,COL3A1,TGFβ-3表达水平的检测

RT-PCR方法检测:取各组样本,用TRIzol裂解液和美国zymo公司生产的RNA抽提试剂盒提取总RNA,测总RNA浓度和纯度,-80℃保存备用。将1μg的总RNA根据TaKaRa的逆转录试剂盒行cDNA逆转录,按照TaKaRa荧光定量聚合酶链反应试剂盒操作步骤进行PCR反应;PCR反应在Real time PCR扩增仪上进行,反应条件:95℃,30 s,95℃,5 s,60℃,34 s,共45个循环。COL1A1(上游5′-GGTGAGACAGGCGAACAAGGTG-3′,下 游 5′-GCCAGGAGAGCCAGGAGGAC-3′),COL3A1(上 游5′-ACTTCTGGTCCTCCTGGTCTGC-3′, 下 游 5′-CGCCTGGCTCACCCTTTTCAC-3′),TGFCTG(上 游5′-CTGGCTCACCCTCATACCT-3′, 下 游 5′-CTGGCTCACCCTCATACCT-3′)的引物,由上海生工生物工程有限公司设计合成。各个基因的表达采用2-△△CT方法进行定量分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件进行正态性和方差齐性检验,计量资料采用平均值±标准差(±s)表示,两组间比较采用团体t检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠外阴脱垂表型变化

与对照组A相比,C、D组大鼠阴道裂孔的直径均超过A组大于2 mm;C、D组与A组之间阴道裂孔直径差异具有显著性[(1.403±0.343)相对(0.419±0.100)](P<0.05)、[(1.609±0.160)相对(0.419±0.100)](P<0.05)。各组大鼠没有明显的脱垂表型,D组表现出轻度的会阴体异常。

2.2 各组大鼠阴道前壁组织COL1A1、COL3A1和TGFβ-3免疫组化积分光密度比较

2.2.1 与A组比较

阴道前壁组织COL1A1的相对表达量B组和A组差异无显著性,C组有下降趋势,但差异无显著性,D组显著低于A组(P<0.05);COL3A1的相对表达量各组大鼠均表现为下降趋势,C、D组均显著低于A组(P<0.05)。TGFβ-3相对表达量与A组相比均呈上升趋势,B组与A组间差异无显著性,C、D组均显著高于A组(P<0.05)(表1)。

2.2.2 组间比较

COL1A1的相对表达量随着损伤强度的增加各组间有依次下降趋势,但差异无显著性。COL3A1的相对表达量C组较B组、D组较C组均呈显著下降(P<0.05)。TGFβ-3相对表达量随着损伤强度的增加C组较B组、D组较C组均显著上升(P<0.05)(表1)。

2.3 各组大鼠骶韧带组织COL1A1、COL3A1和TGFβ-3表达水平比较

2.3.1 与A组比较

骶韧带组织COL1A1、COL3A1相对表达量均呈下降趋势,其中B、C组与A组相比差异均无显著性,D组显著低于A组(P<0.05)。TGFβ-3相对表达量与A组相比均呈上升趋势,B组与A组间差异无显著性,C、D组均显著高于A组(P<0.05)(表2)。

2.3.2 组间比较

COL1A1、COL3A1的相对表达量随着损伤强度的增加C组较B组呈现下降趋势,但差异无显著性,D组较C组呈显著下降(P<0.05);TGFβ-3相对表达量随着损伤强度的增加C组较B组虽差异无显著性,但有上升趋势,D组较C组显著上升(P<0.05)。

表1 各组大鼠阴道前壁组织COL1A1、COL3A1、TGFβ-3免疫组化积分光密度(±s)Table 1 Integral optical density of immunohistochemical staining of COL1A1,COL3A1 and TGFβ-3 in anterior vaginal wall of rats in each group(±s)

表1 各组大鼠阴道前壁组织COL1A1、COL3A1、TGFβ-3免疫组化积分光密度(±s)Table 1 Integral optical density of immunohistochemical staining of COL1A1,COL3A1 and TGFβ-3 in anterior vaginal wall of rats in each group(±s)

注:与A组比较,☆P<0.05;与B组比较,△P<0.05;与C组比较,□P<0.05。Note.Compared with Group A,☆P<0.05.Compared with Group B,△P<0.05.Compared with Group C,□P<0.05.

组别Groups COL1A1 COL3A1 TGFβ-3 A组Group A 51200±14459 172005±2079 84733±6054 B组Group B 53336±12744 168539±1957 84991±6161 C组Group C 50065±14125 135623±5407☆△ 90932±1146☆△D组Group D 44146±9568☆ 103268±4387☆□ 107597±4406☆□F 0.748 586.165 38.743 P 0.533 <0.05 <0.05

表2 各组大鼠骶韧带组织COL1A1、COL3A1、TGFβ-3表达水平(±s)Table 2 mRNA expressions of COL1A1,COL3A1 and TGFβ-3 in sacral ligament tissues of rats in each group(±s)

表2 各组大鼠骶韧带组织COL1A1、COL3A1、TGFβ-3表达水平(±s)Table 2 mRNA expressions of COL1A1,COL3A1 and TGFβ-3 in sacral ligament tissues of rats in each group(±s)

注:与A组比较,☆P<0.05;与C组比较,□P<0.05。Note.Compared with Group A,☆P<0.05.Compared with Group C,□P<0.05.

组别Groups COL1A1 COL3A1 TGFβ-3 A组Group A 1.00±0.02 1.00±0.05 1.00±0.06 B组Group B 0.99±0.02 0.99±0.04 0.99±0.07 C组Group C 0.96±0.04 0.97±0.02 1.22±0.13☆D组Group D 0.50±0.08☆□ 0.54±0.03☆□ 1.65±0.06☆□F 297.257 327.9 122.33 P<0.05 <0.05 <0.05

3 讨论

女性盆腔脏器维持正常位置依赖于子宫骶韧带等盆底支撑组织良好的解剖完整性、组织构成及其正常功能[6]。各种原因损伤的不能自愈的盆底局部解剖上的完整性常常可借助现代不断完善的外科手术而加以解决。而在组织学上,胶原蛋白I型和III型(COL1A1、COL3A1)在阴道壁及子宫骶韧带的支持功能中扮演了重要的角色,近年来的研究提示,胶原蛋白含量减少引起这类支撑组织生物力学特征的改变是导致POP发生的重要原因[7-11]。POP疾病的形成过程缓慢,但多有前期引起盆底组织的急性损伤,这种急性损伤常常伴有一个自我修复的过程,TGFβ-3是参与创伤愈合修复反应的生长因子,能在转录、转录后及翻译水平等多环节增加胶原蛋白的合成[12-14]。在探讨POP疾病的形成过程及各种治疗措施疗效的基础研究中,离不开选择合适的POP动物模型的制作以及评价指标。目前尚没有一种固定的POP动物模型能为这类研究使用。现有的模型多集中在对压力性尿失禁大鼠动物模型的制作,而这种模型是否适用于因骶韧带为主引起的POP疾病的基础研究中尚缺少文献支持。本研究采用大鼠造模前后生殖器表型及阴道壁和骶韧带中胶原蛋白及TGFβ-3的变化来评估其可靠性,以供该类研究制模参考。

现有制作POP模型的动物选择主要有小鼠、大鼠、羊、兔子、灵长类动物和猪等。虽然大型动物如羊和灵长类动物(恒河猴等)等因为其与人类最接近的解剖和组织结构、病理生理、激素水平而被认为是POP最理想的制模动物,但存在生命周期长、研究费用高、研究场地限制等方面的困难[15]。啮齿类动物如大鼠虽可能因为存在与人类解剖上的差异,但具有容易获得、生命周期较短、数量多、经济等优点。有研究提示大鼠的阴道壁结构特征及支持组织与人类相似[16];妊娠及刚阴道分娩后的大鼠阴道壁线性刚度明显下降,且是可逆的,4周后可恢复至正常[17];大鼠手术绝经模型因绝经大鼠阴道壁胶原蛋白呈下降趋势[18]可作为研究POP的模型。但骶韧带中这些结构成分的变化如何文献报告尚少。近年来,有两个在其他物种中有关骶韧带的组织学方面的研究为POP骶韧带研究的动物模型打下基础,Gruber等[19]发现猪具有与人类相似的骶韧带组织成分,适量而丰富的胶原蛋白和平滑肌,可以作为POP研究的动物模型。Iwanaga等[20]做了一个人类、大鼠、小鼠骶韧带组织学方面的比较研究,提示比起小鼠,人类和大鼠的骶韧带有更为相似的胶原和平滑肌含量,且大鼠骶韧带样本较小鼠大,虽然小鼠有基因敲除后其表型与人类临床相似的优点,但仍认为大鼠是一个POP骶韧带相关研究更适合且经济的动物模型来源。考虑到猪作为大型动物在饲养场地、操作等方面的困难,我们选取大鼠作为研究POP骶韧带组织变化的模型无论从哪个角度判断均较为合适。

目前压力性尿失禁大鼠模型是在模拟产伤的基础上联合双侧卵巢切除法,因为这些方法模拟了妊娠难产和绝经,这符合压力性尿失禁的重要发病因素。也同样被认为是POP患者的主要发病原因,这种经典的方法为大家所应用。但研究表明由于大鼠特殊的盆底解剖特点,目前尚无自发性的POP方面的数据。同时妊娠和阴道分娩对于大鼠盆底支持组织生物力特征的影响存在自我修复,而雌激素减退对于盆底组织的影响也是个漫长的过程,选择适时的研究指标检测时机是判断造模成功与否的关键。研究表明大鼠在分娩后4周[17],盆底支持组织可恢复至正常水平,而手术导致的绝经状态始于双侧卵巢切除后15 d,之后雌激素水平会显著下降[21]。所以本实验中我们增加密产因素,每次分娩结束即开始下一次妊娠,且在前一次产伤的短期内即二周时再行产伤模拟操作,第2次模拟产伤2周后即行双卵巢切除术,以增加产伤强度,术后再常规饲养动物8～10周,以增加模型的稳定性及可重复性。

动物模型中盆腔脏器脱垂的客观表型,有一个准确且可重复的量化系统是非常重要的。这样的分级系统在大型动物模型如松鼠猴和狒狒的研究中已被使用[22-23]。在基因敲除的小鼠脱垂模型中也有一套盆腔器官脱垂量化(MOPQ)分级系统[24-25],这套分级系统中,0级和1级被定义为无脱垂表现;2级或3级是中到重度脱垂;4级就是严重脱垂了。小鼠的脱垂牵涉到了一个会阴体的向外膨隆,而人类的脱垂是通过POP-Q分级系统客观评估其外化表型。本研究结果提示采用本方法制作的大鼠模型没有明显的脱垂表型,D组表现出了一个轻度的会阴体异常,其生殖道裂孔较A组相比增加超过2 mm。但其表型特征表现为1级,如以表型变化为研究内容的研究本模型的制作并不合适。

另一方面,模型制作后其重要支撑组织中的组织成分变化为相关研究提供客观的观察指标,本研究中我们用免疫组化的方法测定I型和III型胶原蛋白在各组大鼠阴道前壁中的表达来协同判断POP模型造模成功与否,提示大鼠阴道壁以III型胶原蛋白为主,这与既往研究一致[26]。随着损伤强度的增加,与A组相比,各组III型胶原蛋白的表达均表现出了下降趋势,其中D组的III型胶原蛋白的表达与A组相比存在着显著性下降,这与人类中POP患者与非POP患者阴道壁中胶原含量有相似的变化[10,27-28],进一步说明了D组可以作为研究POP疾病病理生理机制的模型。另外,大鼠阴道前壁TGFβ-3的表达较A组的变化也都能进一步验证。同样,我们使用RT-PCR方法分析了骶韧带中I型和III型胶原蛋白的含量,随着损伤强度的增加,与A组相比,各组骶韧带I型和III型胶原蛋白的表达有依次下降趋势,其中D组骶韧带I型和III型胶原蛋白的表达较A组均表现为显著性下降(P<0.05)。TGFβ-3在骶韧带中的表达随着损伤强度的增加也呈上升趋势,这可能是机体在损伤时的一种应急修复代偿机制,这也与POP患者骶韧带组织中I型和III型胶原蛋白以及TGFβ-3与非POP正常对照组相比时有着相似的变化[14,29-32],说明D组可以作为研究POP骶韧带病理生理变化的动物模型。本组模型没有脱垂表型可能与大鼠特殊的不同于人类的解剖有关,就像敲除了Hoxa11基因的小鼠与人类POP患者一样表现出一个下降的胶原蛋白的表达,但是同样没有脱垂的表现[33-35]。

不难看出,随着损伤强度的增加能得到我们预期的能作为研究POP骶韧带病理生理变化的大鼠模型,且大鼠作为动物模型具有数量多、费用较低、生命周期短等优点,但制作经过是一个耗时耗力的过程,麻醉次数多,且需要开腹手术,有麻醉意外、出血、感染等风险,大鼠死亡率高,造模成功率在70%左右,我们在制模入组时大鼠的量大于最后检测标本的数量,就是基于以上风险考虑的。另外疾病的研究不局限于组织学方面的探索,还包括功能方面的研究,骶韧带因其机械性能在盆底脏器正常位置的支持方面起着非常重要的作用,仅仅骶韧带的组织成分的研究不能确定人类和其他物种的骶韧带的机械性能具有相似性,而这恰恰是对POP机制研究是必须的,啮齿类因其骶韧带组织样本的大小而限制了其机械性研究,这就决定了使用这类动物模型研究的相对局限性。

综上所述,我们认识到没有研究POP的动物模型是完美的,很多模型可以模拟人类的某个特征,比如组织、解剖或是激素,但没有哪个动物模型能同时代表所有的特征。所以对各类动物行一个彻底的解剖、组织学和盆底韧带等的组成及功能方面的研究,结合他们各自的优缺点和需解决的实际研究问题,从而选择最合适的动物模型开展相关研究。而本研究采用增加模拟产伤强度的基础上联合双侧卵巢切除法制作的大鼠模型,至少可以作为探索与POP骶韧带组织胶原变化相关的病理生理变化的动物模型。