左支结扎制备SD大鼠门脉高压动物模型的实验研究

王文晓,柏娟,刘树立

(1.烟台毓璜顶医院儿科,山东 烟台 264000;2.烟台业达医院儿科,山东 烟台 264006;3.首都儿科研究所附属儿童医院普外科,北京 100020)

门脉高压是一种常见的肝疾病,并且其具有较高的死亡率[1-2]。但其确切的发病机制至今尚未完全明确,有研究表明NO在维持门脉高压高动力循环中发挥重要作用[3-5],但绝大多数研究是基于肝硬化导致的门脉高压。肝前型门脉高压中NO是否也发挥类似的作用,国内外研究较少。

上世纪80年代,Van Thiel等[6]首次报道门静脉主干部分结扎制作门脉高压动物模型,国内外众多研究者对这一模型进行复制、研究,取得了不错的结果[7]。一例由于门静脉左支中断而形成的肝前型门脉高压引发思考,单纯行门静脉左支部分结扎是否也会形成稳定的门脉高压?NO在其中是否发挥相应作用?现通过动物实验报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

8周龄SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只,体重260～280 g,平均体重268 g,北京华阜康生物科技股份有限公司提供【SCXK(京)2019-0008】,饲养于山东国际生物科技园发展有限公司【SYXK(鲁)2018-0030】。饲养期间各组大鼠自由饮水,饲喂普通维持饲料由青岛今墨堂生物技术有限公司【SCXK(鲁)2018-0009】提供。饲养环境:昼夜各半循环照明,湿度恒定,温度控制在21～25℃。所有操作均符合首都儿科研究所实验伦理学要求(审批号:SEDDLL-20190045)。

1.1.2 实验试剂与仪器

大鼠NO试剂盒(上海臻科生物科技有限公司提供),BL-420生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司生产)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

36只大鼠随机分为6组,每组6只。分别为直径0.6、0.7、0.8 mm针门静脉左支结扎组,直径0.9 mm针门静脉主干结扎组,肝左外叶切除组,假手术组。

1.2.2 实验方法

所有实验动物术前晚禁食,手术采用3%戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉。麻醉约10 min后开始手术,手术从剑突向下作2 cm腹部正中切口,暴露、游离门静脉主干至门脉左右支分叉,继续向上游离门静脉左支。左支结扎组分别用直径0.6、0.7、0.8 mm针,平行置于门静脉左支旁,用4号丝线将门静脉左支与直针一起结扎,缓慢旋转抽出直针;主干结扎组用直径0.9 mm针,平行置于门静脉主干旁,其余与前相同;左外叶切除组游离左外叶,并在左外叶根部结扎血管,切除左外叶;假手术组不作门静脉部分结扎,其余与左支结扎组相同,测压后关腹。

1.2.3 观察指标及方法

(1)观察大鼠术后是否苏醒及存活。

(2)门静脉测压:取回肠系膜较平直静脉,用充满肝素盐水的24G套管针穿刺,穿刺针置于肠系膜血管主干或一级属支内,通过压力传感器链接BL-420生物机能实验系统以读取各组大鼠门静脉压力。术后15 d及30 d所有实验大鼠均按上述相同方法测量门静脉压力。

(3)术后30 d处死所有大鼠,用真空采血管收集大鼠门静脉血液并剪取肝左、右叶部分组织,用NO试剂盒测量各组NO含量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析,两组间比较采用独立样本t检验分析。计量资料采用平均值±标准差(±s)表示,以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物存活情况

所有大鼠均于术后24 h内苏醒。术后第2天,门静脉主干结扎组因门静脉淤血死亡大鼠1只,余均顺利存活。术后30 d,存活大鼠体重282～302 g,平均体重289 g。

2.2 各组大鼠不同时间点门静脉压力情况

(1)左支结扎三组大鼠术后即刻、术后15 d、术后30 d门静脉压力较各自术前及同时间点假手术组均明显升高(P<0.05),且针直径越小,其术后压力越高。

(2)主干0.9 mm组大鼠术后即刻、术后15 d、术后30 d门静脉压力较各自术前及同时间点假手术组均明显升高(P<0.05);左外叶切除组术后即刻、术后15 d门脉压力较术前及同时间点假手术组高(P<0.05),但术后30 d二者无统计学差异;假手术组大鼠门静脉压力随时间推移无明显变化。

(3)左支结扎三组大鼠术后即刻、术后15 d门静脉压力低于主干0.9 mm组;至术后30 d左支0.7、0.8 mm组门静脉压力低于主干0.9 mm组,但左支0.6 mm组门静脉压力与主干0.9 mm组差异无显著性表达[(16.82±2.16)cm H2O vs(18.74±3.20)cm H2O,P>0.05)]。

2.3 组织及血液NO含量

对六组SD大鼠肝左、右叶组织及血液中NO含量进行比较,各组间均无显著性差异(P>0.05)(见表2)。

表1 各组大鼠不同时间点门脉压力(cm H 2O)Table 1 Portal vein pressure of SD rats at different time of six groups(cm H2O)

表2 SD大鼠肝左右叶及血液NO含量(μmol/L)Table 2 NO concentration of SD rats in blood,left and right lobes of liver tissue(μmol/L)

3 讨论

虽然门静脉主干结扎法制备大鼠门脉高压动物模型目前在国内外已得到广泛应用,但其术后死亡率仍然较高,可达到20%甚至更高[8]。本研究亦有一只大鼠死亡。分析原因,主要为门静脉血液回流不畅,胃肠道及脾大量淤血,肠管紫绀坏死,且易出现大量腹水,容易导致大鼠死亡。而单纯门脉左支结扎大鼠并不会出现以上情况,因为单纯门脉左支结扎,门静脉右支保持畅通,胃肠道及脾静脉无严重淤血,肠管不会缺氧坏死,故其术后死亡率低。SD大鼠肝分为左外叶、左中叶、右叶、尾状叶和二乳突叶,左肝约占全肝重量的70%,而门静脉占肝大约75%血液供应,故单纯门静脉左支结扎即可严重影响肝血液供应。但目前国内外对单纯门静脉左支部分结扎能否制备门脉高压动物模型研究较少。

本研究显示,六组SD大鼠结扎前门静脉压力约为10.37 cm,与文献中正常SD大鼠门静脉压力值大致相同[9],单纯门静脉左支结扎的SD大鼠,其术后门静脉压力较术前及对照组均明显升高,且至术后30 d 0.6 mm针结扎门脉左支的大鼠与门脉主干部分结扎的大鼠其门静脉压力差异无显著性表达[(16.82±2.16)cm H2O vs(18.74±3.20)cm H2O,P>0.05)],所以单纯门脉左支部分结扎也可取得较好的门脉高压模型。

国内外研究显示,对于体重250～300 g的雄性SD大鼠,结扎门静脉主干最合适的是20G直针(即相当于9号针,直径0.9 mm)[7,10],既能保证动物较低的死亡率,又能最大限度的提升门静脉的压力。但对于门脉左支部分结扎的合适口径,国内外并无报道。由于门静脉分为左右两支,因此在实验中我们分别应用更细的0.6、0.7、0.8 mm针对门静脉左支进行结扎,三组大鼠术后即刻、术后15 d及术后30 d门脉压力均较术前明显增高,其中利用直径0.6 mm针结扎左支SD大鼠其术后各时间点门静脉压力均为最高,且在术后30 d其与主干结扎大鼠门静脉压力无统计学差异,因此使用直径0.6 mm针对门静脉左支进行部分结扎即可取得较好效果。因为大鼠门静脉左支供应左外叶、左中叶,而这其中左外叶占据大部分,所以切除左外叶可有效减少门静脉左支的血液供应。而肝切除后是否伴随着门静脉压力的增高,仍存在着争议。本研究发现,肝左外叶切除后,门静脉压力立即上升,随着时间推移,肝左叶切除组门脉压力稳步下降,至术后1个月其与对照组已无统计学差异,这提示我们仅仅减少肝左叶血供并不能形成稳定门脉高压模型;而门脉左支部分结扎则能形成较为稳定的门脉高压模型,由此分析,有可能是门脉左支狭窄导致相关因子产生或增减,维持了门脉高压的状态,因此我们进一步研究了NO在其中是否起到相应作用。

之前有研究显示,蛋白C、蛋白S、抗凝血酶Ⅲ降低与肝外型门脉高压相关[11-12]。而在肝内型门脉高压,NO与肝血管收缩、舒张功能失调及新生血管生成密切相关[3,4,13]。肝硬化时肝内NO合成减少,导致肝内血管阻力增加,门脉压力升高;与此同时,外周循环NO合成增多,使内脏血管扩张、血流量增多,进一步促使门静脉高压形成[5,14]。

本研究发现,术后30 d各组SD大鼠肝内及血液内NO含量差异无统计学意义。这提示我们,肝外型门脉高压与肝内型门脉高压发生原理并不相同,在肝外型门脉高压中NO可能并没有起到关键作用。而最近有研究提示,对门脉结扎的SD大鼠使用促NO产生的生物制剂并不能有效降低门脉压力,而对肝硬化的SD大鼠使用促NO产生的生物制剂则能有效降低门脉压力[15-16]。这与我们研究相符。

但限于本研究时间较短,对术后长期门脉压力及其影响因素研究较少。希望以后有更大样本、更长时间的类似研究。