克罗恩病大小鼠动物模型研究进展

方磊,乔立超,顾一帆,徐雪梅,杨柏霖,陈红锦

(南京中医药大学附属医院,南京 210029)

克罗恩病(Crohn’s disease,CD)是一种非特异性肠道炎性疾病,属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)的一种,其病变可累及全消化道,最常见的是回肠或结肠的透壁间断性炎症,随着疾病的发展,半数患者会出现并发症(狭窄、肠瘘或脓肿),通常需要手术治疗[1]。CD的确切发病机制尚不明确,一般认为是因环境、遗传、免疫以及微生物间复杂的相互作用而致病的[2]。西方发达国家CD的发病率已趋于稳定,而我国的发病率正逐年上升,且呈低龄化发展[3]。目前用于治疗CD的药物也只是缓解患者症状,维持治疗,而不是改变或逆转潜在的致病机制。在剖析特定药物的可能作用机制,研究开发其他替代治疗方案中,动物模型发挥着至关重要的作用。近些年用于研究CD的动物模型主要包括化学诱导模型、自发模型、基因工程模型和细胞移植模型等。这些模型为研究疾病的发病机制以及发掘潜在的治疗靶点提供了可能。本文旨在对CD动物模型进行综述,并阐述其机制、模型应用的优缺点。

1 化学诱导动物模型

1.1 2,4,6-三硝基苯磺酸动物模型

2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)是一种半抗原,可与高分子组织蛋白结合成为抗原,诱发以T细胞介导的细胞免疫反应,从而造成结肠炎症。目前TNBS诱导多选用SD、Wistar大鼠和BALB/c、SJL/J、WT、C57BL/6J小鼠,大鼠模型在形态上与人类肠道结构相似方面表现出优势,并且易于操作,而小鼠模型具有更广泛的遗传特征。用药采用灌肠的方式,用乙醇作为载体增加黏膜的通透性[4],使TNBS可进入局部肠组织,与高分子组织蛋白结合。不同品系的大小鼠对TNBS的易感浓度不同,可能与不同品系的大小鼠携带的肠道菌株不同有关,临床上在使用TNBS诱导CD动物模型时需根据个体优化TNBS浓度[5]。动物组织可见肠壁增厚,溃疡形成,肌层破坏,肉芽肿形成,类似CD[6]。TNBS诱导的结肠炎可用于研究急性结肠炎、中程结肠炎以及慢性结肠炎,其中慢性结肠炎与纤维狭窄型CD具有相似的病理改变[5]。该模型具有造模简单、模型持续时间长、费用低以及与人CD有相似的病理改变等优点。但TNBS动物模型缺乏自发性复发和进行性的体重减轻、血性腹泻等症状,且动物死亡率高。

1.2 2,4-二硝基苯磺酸动物模型

2,4-二硝基苯磺酸(dinitrobenzene sulfonic acid,DNBS)与TNBS一样,也是半抗原,同样也需要乙醇作为载体来破坏黏膜屏障,并选用SD大鼠和WT、Wistar、NMRI小鼠作为诱导动物。DNBS较TNBS少一个活性硝基,所以需要更高的浓度才易与组织高分子蛋白质结合成抗原,但在结合蛋白质时DNBS具有选择性,它只与赖氨酸的ε-氨基团结合[7]。研究[8]表明DNBS动物模型的肠道损伤与活性氧(reactive oxygen species,ROS)有关,DNBS在动物体内代谢的产物会导致氧化应激,增加ROS的产生,过多的ROS会增加谷胱甘肽的消耗,更多的不饱和脂质降解而损伤肠道。DNBS动物组织肉眼可见结肠、盲肠和直肠存在严重炎症和出血性溃疡,病理改变为广泛的形态学紊乱、水肿、弥漫性白细胞浸润以及结肠黏膜下层的淋巴细胞浸润[9]。该模型的结肠炎特征与TNBS模型相似,有明显的血性腹泻和体重减轻,但相对危害较小[10]。同样具有重复性高,价格低廉等优点,但目前国内对DNBS动物模型的报道较少,仍需进一步验证该模型的适用面。

1.3 吲哚美辛动物模型

吲哚美辛是一种非甾体类抗炎药,本法用到的吲哚美辛需用无水乙醇彻底溶解后再用5%的碳酸氢钠溶液稀释。动物模型一般选用SD、Wistar大鼠,多采用皮下注射的方式进行给药,皮下给药24 h急性炎症达到最高峰,后期每天再给药诱导慢性炎症,这种慢性炎症至少会持续两周,临床会出现急性肠炎,以肠壁增厚、肠系膜出血、肠系膜粘连以及小肠和结肠的多发性黏膜溃疡为主要特点[11]。虽然小肠溃疡和透壁炎症与CD有相似之处,但动物模型的慢性溃疡主要存在于小肠而不是回肠[11]。通常认为吲哚美辛抑制了前列腺素、前列腺环素、环氧合酶,打破了肠黏膜的动态平衡,并在肠道菌群的参与下诱发了肠炎[12]。该模型的肠道急性或慢性炎症的制备比较容易,溃疡与CD有许多相似之处,缺点是其溃疡发生部位不是特征性的回肠。

1.4 肽聚糖-多糖动物模型

肽聚糖-多糖(peptidoglycan-polysaccharide,PGPS)是细菌细胞壁成分,在体内和体外均有良好的促炎作用[13-14]。PG-PS的肽聚糖部分含有NOD2配体的胞壁酰二肽部分,后者是CD的主要致病易感基因的产物[13]。目前PG-PS动物模型多选用易感的Lewis大鼠造模[13,15-17],并需剖腹将药物注射进肠道壁内,主要注射部位有回肠最远端两个派尔斑、远端回肠系膜、盲肠尖端和盲肠壁[13,18]。PG-PS动物模型的急性炎症期在1～2 d到达高峰,7～10 d为静止期,随后12～17 d进入慢性肉芽肿性炎症阶段,并伴有显著的肠纤维化改变[15,17,19]。与其他动物模型相比,PG-PS诱导的慢性小肠结肠炎模型具有的特点[16-17]:(1)炎症是慢性的和肉芽肿性的;(2)炎症发生了自发的再激活;(3)肠外损害(关节炎、肝脏肉芽肿、贫血)伴随着肠道炎症;(4)慢性炎症存在遗传易感性;(5)在远端的小肠和结肠中发现类似的细菌细胞壁聚合物。该模型的优点是,病变累及末端回肠和右半结肠,组织学特征包括肉芽肿性炎症和显著的纤维化,以及有CD患者常见的肠外表现,如关节炎等。此外,在这个模型中的炎症是T细胞介导的[17],且具有相似的炎症细胞因子谱[14]。当然缺点也很明显,该诱导方式需要手术操作,且肠内注射部位需定位准确,对研究人员要求相对较高。

2 自发性动物模型

自发性动物模型是指未经特殊的人工干预的实验动物,在自然条件下发生或由于基因突变出现的异常表现,并通过遗传育种保留下来的动物模型[20]。目前,常用的CD样自发性动物模型有SAMP1/Yit小鼠和SAMP1/YitFc小鼠。

SAMP1品系是由一窝AKR/J小鼠经24代同胞后代交配所建立的一系列易衰老品系之一,SAMP1小鼠寿命短(约9个月),并表现出早期衰老的迹象,如自发性淀粉样变性、脱发和骨质疏松[21]。在该品系的F1代中选择有皮损的小鼠,进行兄妹间交配20余次,建立了SAMP1/Yit品系,与最初的SAMP1不同,SAMP1/Yit小鼠没有出现淀粉样变性,寿命也没有缩短,并且在这个新的亚系中还观察到了回肠炎性疾病[21]。SAMP1/Yit小鼠在20周龄时首先出现轻度至中度回肠炎,并在30周龄时在回肠末端形成100%外显的不连续的透壁炎性病变,组织学发现回肠病变以炎症和上皮细胞增生导致肠壁增厚,固有层和黏膜下层炎症细胞浸润为主,病变的严重程度和发生率随年龄增加,没有明显的肠外炎症[22]。

SAMP1/YitFc小鼠是将原先的SAMP1/Yit种群进行超过20代的兄妹间交配繁殖,繁育出带有新的表型的小鼠。与原先的SAMP1/Yit小鼠相比,SAMP1/YitFc小鼠早在10周龄时即可出现回肠炎,并可早在4周龄时即可测得高水平IFN-γ,在慢性回肠炎病变部位可发现肌肥大和局部胶原沉积,肠系膜淋巴结中的淋巴细胞活性表型与疾病进展有关,皮损发生率与肠道炎症发生呈负相关,大约5%的小鼠可产生肛周病变如溃疡或瘘管[23]。另外SAMP1/YitFc小鼠还被报道发展为克罗恩样胃炎(在没有幽门螺杆菌感染的情况下)[24],自身免疫性肝炎[25],牙周炎[26]等。SAMP1/Yit小鼠及SAMP1/YitFc小鼠疾病表现与人类CD极其相似,但是成因暂不完全清楚,小鼠繁殖能力较差,与其他模型相比,需要大量的繁殖群体来生产实验小鼠,维持品系稳定的成本较高。

3 基因工程动物模型

基因工程动物模型即运用基因敲除或转基因手段获得目的基因缺陷的动物模型,用来研究目的基因在IBD免疫发病机制中的作用。近些年基因工程动物模型被广泛用于生物学、医学、药学等领域,取得了丰硕的研究成果。在人类疾病研究中,基因工程技术为深入研究人类疾病的本质带来了可能,并已显示出积极的应用前景,现就常见的基于基因工程技术建立的CD动物模型进行介绍。

3.1 基因敲除动物模型

基因敲除动物模型是指运用分子生物学技术将目的基因去除,或用其他相近的基因将其替换而得到的动物模型。目前除了单个目的基因敲除动物模型,应用更多的是将各种目的基因敲除后的动物模型进行杂交,选取目的基因双重甚至多重敲除后代进一步研究多基因缺陷与CD的关系,从而试图阐明CD与特定基因背景的联系。此类动物模型逐年增多,但都是在单个目的基因敲除的基础上进行杂交,保留需要的目的基因缺陷动物,这里就不再一一赘述。总而言之,目前研究人员通过基于体外逆转录病毒的基因治疗或通过使用可分泌相关细胞因子的转基因细菌进行实验性治疗,为开发新药提供了新思路,基因敲除动物模型的应用正逐渐成为研究人员的首选,下面简要列举几种目前常见的基因敲除动物模型(表1)。

3.2 转基因动物模型

转基因动物模型是指运用分子生物学实验技术将外源性基因整合到动物体内,并可稳定表达,也可稳定遗传给后代的一类动物模型。与基因敲除动物模型不同的是转基因动物模型目的基因为外源性基因,它突破了种系隔离,可以进行更广泛的目的基因研究,例如当想研究人类具有而动物不具有的基因时,即可以选择该基因的转基因动物模型进行研究。

表1 克罗恩病基因敲除大小鼠动物模型概况Table 1 The summary of genetic knockout rat and mouse models of Crohn’s disease

3.2.1 STAT 4转基因动物模型

STAT 4基因是一种编码转录调节因子,与IL-12受体信号转导有关,IL-12对TH1细胞因子如IFN-γ的调节至关重要[44]。STAT4转基因小鼠出现类似人CD的体重减轻、腹泻和严重结肠炎[45]。这种模型的致病机制可能是异常的IL-12参与激活Th1途径,破坏肠黏膜免疫平衡,引起免疫紊乱而出现类似CD的结肠炎[44]。

3.2.2 HLA-B27转基因动物模型

人类白细胞抗原-27(human leukocyte antigen-27,HLA-B27)与人类强直性脊柱炎关系密切[46]。HLA-B27转基因大鼠会自发形成IBD,影响胃、回肠,特别是整个结肠,组织学表现为隐窝增生、黏膜单核细胞浸润和浅表溃疡等[47]。该模型已广泛用于研究常驻肠道细菌对胃肠道炎症的急性和慢性阶段的作用[48]。

4 CD45RBHigh细胞移植动物模型

CD45RBHigh细胞移植动物模型是通过将幼稚CD45RBHighT细胞经尾部注入重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient,SCID)小鼠体内,4周后Th1型免疫反应模型建立,IFN-γ、TNF-α水平明显增高[49]。这些小鼠在细胞转移后的5～8周内出现严重的小肠炎和胰腺炎,病变以近端结肠为主,组织学表现主要有肠壁增厚、炎性细胞浸润和隐窝缺失,类似人CD的表现,结肠炎的严重程度可因供体和受体小鼠的品系而不同[50-51]。

5 异种小肠移植动物模型

异种小肠移植动物模型用胎龄12～18周人胎小肠移植于6～8周龄的SCID小鼠背部皮下或空肠系膜侧,生长12～16周后收获异种小肠[52]。人胎儿小肠和大肠移植的成功率约为62%,移植后的人胎儿小肠和大肠均能维持6个月之久,并出现新生血管的形成,所有肠道均具有适龄成熟和正常的大体组织学特征[53-55]。异种肠道移植物中存在人类固有免疫细胞和获得性免疫细胞,肠道中人IL-8、IL-1β、IL-6、TNF-β、A20等表达明显升高,大约17%的人体异种肠道移植动物模型会自发性地发生肠皮肤瘘,并与人CD瘘管的组织病理学特点极其相似[56]。该模型成功建立了CD瘘管动物模型,缺点是技术要求高,成功率低。

6 结语

上述动物模型的建立是目前研究人员在对CD病因认识的基础上运用生物学技术诱导的,其中化学诱导法主要是在肠上皮的完整性被破坏或在黏膜的通透性增加的情况下使得抗原发生免疫反应而致病,而基因工程动物模型、CD45RBHigh动物模型以及异种小肠移植动物模型是基于遗传免疫缺陷诱导了CD发生。然而离开共生菌群的参与,这些动物模型大部分都无法成功诱导,有研究[57]表明在无菌环境下,这些大小鼠无法发生IBD,所以我们仍需对CD进行更深层次的研究。随着人们对CD的认识逐渐清晰,肯定会有更多的动物模型被建立,研究人员才可以更好地利用每种模型的特点选取合适的一种来发掘特定的病理生理问题。虽然目前没有一个单一的动物模型能够概括人类CD的所有致病和临床特征,但每个动物模型对我们更好地理解CD的发病机制及发掘可用的治疗靶点能够提供帮助。如果适当地选择动物模型,则可以探索疾病确切的病理机制,也将使开发新药和治疗手段变得容易,动物模型的研发仍然需要我们再做进一步的探索。