玉米肽的酶法糖基化修饰及产物溶解性的研究

王晓杰 ，刘晓兰 ，石彦国

(1.哈尔滨商业大学 食品工程学院，黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室， 哈尔滨 150076； 2.齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江省普通高校农产品加工重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

食品蛋白质的糖基化修饰，是将亲水的糖类物质以共价键连接的方式导入食品蛋白质分子之中，使修饰产物同时具有蛋白质的大分子特性及糖类物质的亲水特性[1]。目前，食品蛋白质糖基化修饰的方法有两种，分别是美拉德反应和转谷氨酰胺酶(TGase)催化的酶法糖基化，后者由于具有反应特异性强、反应条件温和、反应产物食用安全等特点而备受关注[1]。

目前，TGase的酶法糖基化已经成功应用于大豆蛋白[2]、黑豆蛋白[3]、酪蛋白[4]、乳清蛋白[5]、豌豆蛋白[6]、燕麦麸皮球蛋白[7]等食物蛋白质的改性中。 近年来，开始有通过TGase生物催化多肽与氨基糖合成糖肽的报道。Hong[8]、Gottardi[9]等用TGase分别催化鱼皮胶原蛋白肽、小麦谷蛋白肽与氨基葡萄糖合成了糖肽。与未糖基化的肽相比，糖肽的抗氧化活性和抗菌活性都得到了显著提高。

玉米肽是以玉米蛋白粉为原料，经蛋白酶水解后得到的相对分子质量很小但活性很高的短肽分子组成的混合物[10]。玉米肽安全可靠，无毒副作用，是一种天然的食品蛋白，具有醒酒、抗疲劳、提高机体免疫力等功能。然而，在玉米肽的制备过程中，存在生物活性释放程度低等问题。如果将蛋白酶的酶解技术与TGase的酶法糖基化技术相结合，将有望利用氨基糖的结合实现玉米肽功能性质的显著提高。目前，除本课题组外，未见利用TGase催化合成玉米糖肽的相关报道。本实验以玉米醇溶蛋白为原料，先利用Alcalase碱性蛋白酶酶解制备玉米肽，再利用TGase催化氨基葡萄糖与玉米肽分子共价结合，优化了糖基化反应条件，对修饰产物的溶解性进行研究，以表征糖基化修饰对玉米肽功能性质的影响，以期为进一步研究玉米糖肽的生物活性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

玉米醇溶蛋白，Sigma公司；碱性蛋白酶Alcalase，丹麦诺维信公司；TGase，泰兴市一鸣生物制品有限公司；D-氨基葡萄糖、即用型透析装置(100～500 Da)，上海生工生物工程有限公司；3，5-二硝基水杨酸，天津市化学试剂厂；苯酚，天津科密欧试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

DF-I集热式磁力加热搅拌器，常州荣华仪器制造有限公司；SHZ-A恒温水浴振荡器，上海跃进医疗器械厂；DF-Ⅱ氮吹仪，江苏省金坛市医疗仪器厂；DU800紫外可见分光光度计，贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司；PB-10 pH计，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米肽的制备

取3 g玉米醇溶蛋白配成质量浓度为3 g/100 mL的悬浮液，用0.5 mol/L NaOH调pH至8.5，加入0.15 g Alcalase碱性蛋白酶，在60℃条件下进行酶解反应。2 h后取出立即沸水浴灭酶15 min，冷却至室温后经4 000 r/min离心15 min，取上清液放于-80℃冰箱中冻结，冷冻干燥48 h后获得玉米肽。

1.2.2 玉米肽的糖基化修饰

将1.2.1中制备的玉米肽配制成溶液，加入氨基葡萄糖混合均匀，加热到一定温度并用2 mol/L NaOH调整至合适的pH，加入TGase开始糖基化反应。糖基化反应结束后，反应液于85℃水浴中热处理5 min以钝化TGase，冷却至室温。将反应液装入截留相对分子质量为100～500 Da的即用型透析装置中，将透析装置放入1 000 mL的烧杯中，加入1 000 mL 蒸馏水。每隔2 h换一次蒸馏水，透析48 h，至透出液的电导率接近蒸馏水为止，将未反应的氨基葡萄糖和游离氨基酸透析除去。收集样液，冷冻干燥获得玉米糖肽。

1.2.3 接糖量的测定

采用DNS法测定接糖量[11]。准确称取0.01 g样品，放于安瓿管中，加入2.5 mL、6 mol/L HCl，在氮气条件下对安瓿管进行烧管密封。将密封后的安瓿管放在100℃烘箱中进行酸水解，7.5 h后取出安瓿管，自然冷却至室温。过滤，取0.8 mL滤液，加入0.7 mL 6 mol/L NaOH和1.5 mL的DNS试剂，沸水浴5 min，取出后流水冷却至室温，再加入1 mL蒸馏水，摇匀后测定540 nm处的吸光值，将测定的吸光值代入氨基葡萄糖标准曲线(y=0.002x-0.026，y为吸光值，x为氨基葡萄糖含量)，计算接糖量。接糖量=氨基葡萄糖量/玉米肽质量。

1.2.4 玉米糖肽溶解性的测定

准确称取0.02 g玉米糖肽，分别加入10 mL pH 3～11的缓冲溶液，旋涡混匀30 s后放置在4℃冰箱中过夜，使样品充分水合。4℃条件下10 000 r/min 离心10 min，收集上清液后采用Folin-酚法测定蛋白质含量。用上清液中总蛋白含量占样品中总蛋白含量的比例表示样品的溶解性。

2 结果与讨论

2.1 糖基化反应单因素实验

2.1.1 最适反应初始pH的确定

在反应温度44℃、玉米肽质量分数3%、玉米肽与氨基葡萄糖质量比1∶2、TGase添加量50 U/g(以玉米肽质量计，下同)、反应时间7 h的条件下，研究反应初始pH对接糖量的影响，实验结果如图1所示。

图1 反应初始pH对接糖量的影响

由图1可以看出，随着pH的增大，接糖量呈先升高后降低的趋势，在pH为7.7时，接糖量达到最大值，为86.91 mg/g。而当pH大于7.7时，接糖量开始降低。pH是影响TGase催化活力和氨基糖氨基解离的一个重要因素。在pH大于8.0时，可能由于TGase催化活力降低或者氨基葡萄糖的氨基发生质子化[12]，影响了玉米肽与氨基葡萄糖之间的共价结合反应，导致玉米肽中糖基的导入量降低。这与TGase催化壳寡糖与玉米醇溶蛋白共价结合的结果一致[13]。因此，选择最适反应初始pH为7.7。

2.1.2 最适反应温度的确定

在反应初始pH 7.7、玉米肽质量分数3%、玉米肽与氨基葡萄糖质量比1∶2、TGase添加量50 U/g、反应时间7 h的条件下，研究反应温度对接糖量的影响，实验结果如图2所示。

图2 反应温度对接糖量的影响

由图2可以看出，随着反应温度的升高，接糖量呈先升高后降低的趋势，在反应温度为44℃时，接糖量达到最大值，为73.13 mg/g。当反应温度超过44℃时，接糖量开始降低。在一定温度范围内，随着反应温度的升高，TGase活力增强，有利于糖基化反应的进行，而当反应温度超过TGase的最适温度时，高温会导致TGase活力的降低，同时TGase催化的糖基化反应的竞争性反应脱酰胺作用也会加剧[13]。因此，选择最适的糖基化反应温度为44℃。

2.1.3 最适玉米肽质量分数的确定

在反应初始pH 7.7、反应温度44℃、玉米肽与氨基葡萄糖质量比1∶2、TGase添加量50 U/g、反应时间7 h的条件下，研究玉米肽质量分数对接糖量的影响，实验结果如图3所示。

图3 玉米肽质量分数对接糖量的影响

由图3可以看出，随着玉米肽质量分数的增加，接糖量呈先增加后减小的趋势。当玉米肽质量分数为3%时，接糖量达到最大值，为75.29 mg/g。可能是随着玉米肽质量分数的提高，玉米肽和氨基葡萄糖分子之间的碰撞概率明显增加，同时TGase催化的反应活性位点增加，有利于糖基的导入；但当玉米肽质量分数增加到4%时，反应体系的黏度增大或反应活性位点饱和，不利于酶促反应进行，从而影响了糖基化反应的进行。刘金玲等[14]在研究玉米谷蛋白与壳寡糖的酶法糖基化反应条件时得出相同的结论。因此，选择最适的玉米肽质量分数为3%。

2.1.4 最适氨基葡萄糖添加量的确定

在反应初始pH 7.7、反应温度44℃、玉米肽质量分数3%、TGase添加量50 U/g、反应时间7 h的条件下，研究氨基葡萄糖添加量对接糖量的影响，实验结果如图4所示。

图4 氨基葡萄糖添加量对接糖量的影响

由图4可以看出，随着氨基葡萄糖添加量的增加，接糖量逐渐增加。当氨基葡萄糖添加量较低时，氨基葡萄糖与玉米肽分子碰撞的概率较小，因而氨基葡萄糖的导入量较小。当增大氨基葡萄糖添加量时，蛋白质分子与糖分子之间的碰撞概率增加，有利于糖基化修饰反应的进行；当玉米肽与氨基葡萄糖质量比为1∶4时，接糖量达到最大值，为166.19 mg/g。但一味地增大接糖量会增加生产成本。因此，综合考虑，选择最适的玉米肽与氨基葡萄糖质量比为1∶3。

2.1.5 最适TGase添加量的确定

在反应初始pH 7.7、反应温度44℃、玉米肽质量分数3%、玉米肽与氨基葡萄糖质量比1∶3、反应时间7 h的条件下，研究TGase添加量对接糖量的影响，实验结果如图5所示。

图5 TGase添加量对接糖量的影响

由图5可以看出，随着TGase添加量的增加，接糖量整体呈先升高后降低的趋势。当TGase添加量为50 U/g时，接糖量达到129.57 mg/g，继续增大TGase添加量，接糖量逐渐减小。由米氏方程可知，当底物浓度一定时，酶促反应速率与酶浓度成正比。但当TGase添加量过高时，加大了玉米肽分子自交联的机会，较大的空间位阻阻碍糖基的导入，这与全越等[12]的研究结果相一致。因此，选择最适的TGase添加量为50 U/g。

2.1.6 最适反应时间的确定

在反应初始pH 7.7、反应温度44℃、玉米肽质量分数3%、玉米肽与氨基葡萄糖质量比1∶3、TGase添加量50 U/g的条件下，研究反应时间对接糖量的影响，实验结果如图6所示。

图6 反应时间对接糖量的影响

从图6可以看出，随着反应时间的延长，接糖量呈先升高后降低的趋势。在反应时间为7 h时，接糖量达到最大值，为139.22 mg/g。而当反应时间长于7 h时，接糖量开始降低。分析可能的原因有两方面，一方面是pH为7.7的弱碱性反应条件下，生成的玉米肽糖基化修饰产物可能不稳定而发生降解；另一方面是达到一定反应时间后，酶促反应趋于平衡，产物增加的同时使分子的空间位阻效应更加明显，从而抑制酶促反应的发生[15]，不利于糖基的导入。因此，选择最适的反应时间为7 h。

2.2 正交实验

固定反应初始pH 7.7、反应温度44℃、玉米肽与氨基葡萄糖质量比1∶3，采用L9(34)正交实验设计对接糖量影响较大的3个因素TGase添加量、玉米肽质量分数和反应时间进行优化，正交实验因素水平如表1所示，正交实验设计及结果如表2所示。

表1 正交实验因素水平

表2 正交实验设计及结果

由表2可知，各因素对接糖量影响的大小顺序依次为玉米肽质量分数>反应时间>TGase添加量。氨基葡萄糖糖基化修饰玉米肽的最优实验组合为A3B3C2，即TGase添加量55 U/g，玉米肽质量分数3.5%，反应时间7 h。在最优条件下，接糖量为148.44 mg/g。经3次验证实验，得到的接糖量为149.60 mg/g，远大于玉米醇溶蛋白和玉米谷蛋白中单糖和壳寡糖的接入量[11,14]，推测是蛋白酶的酶解作用将玉米醇溶蛋白的空间位阻降低，同时使包埋在蛋白质分子内部的活性位点暴露出来，增加了酶与底物之间的反应效率，使氨基糖的接枝度增大。

2.3 玉米糖肽的溶解性

以玉米肽为对照，测定在pH 3.0～11.0范围内玉米糖肽的溶解性，结果如图7所示。

由图7可以看出，在pH 3.0～11.0范围内，玉米肽的溶解性显著升高，且未出现等电点，这与课题组报道[15]的玉米肽在较宽的pH范围内能保持良好的溶解状态结论一致。经氨基葡萄糖糖基化修饰后，玉米肽的溶解性进一步提高，在pH 6.0时，玉米糖肽的溶解性比玉米肽提高16.31%，可能是由于氨基葡萄糖所提供羟基基团的增加造成的[16]，也进一步说明糖基化修饰改善了玉米肽的带电荷性质，为玉米糖肽生物活性的发挥奠定基础。

图7 糖基化修饰对玉米肽溶解性的影响

3 结 论

以玉米醇溶蛋白为原料，先利用Alcalase碱性蛋白酶酶解制备玉米肽，再以TGase为催化用酶，氨基葡萄糖为酰基受体，通过糖基化反应修饰玉米肽，以接糖量为指标，采用单因素实验和正交实验确定了氨基葡萄糖糖基化修饰玉米肽的糖基化反应条件为：反应初始pH 7.7，反应温度44℃，玉米肽质量分数3.5%，玉米肽与氨基葡萄糖质量比1∶3，TGase添加量55 U/g，反应时间7 h。在最优工艺条件下，接糖量为149.60 mg/g。与玉米肽相比，在pH 6.0时，玉米糖肽的溶解性提高16.31%。同时，糖基化修饰改善了玉米肽的带电荷性质。在今后的研究中，可以通过体外化学法和体内实验进一步开展玉米糖肽生物活性等方面的研究，为其在食品工业中的应用奠定理论基础。