固定化脂肪酶催化红花油乙醇醇解反应的研究

竺少铭1，王升帆2，吴 鹏，张石自，郑建永，汪 钊

(1.浙江医药股份有限公司 昌海生物分公司，浙江 绍兴 312000；2.浙江医药股份有限公司 新昌制药厂，浙江 新昌 312500；3.浙江工业大学 生物工程学院，浙江 杭州 310014)

红花油又名红花籽油，由红花籽制备而来。红花油中含有大量的不饱和脂肪酸，营养价值极高，主要成分为亚油酸，国标中规定红花油中亚油酸含量最低为67.8%。而且红花油具有很高的医用价值，是制备亚油酸乙酯的良好原料[1]。目前，国内外制备脂肪酸乙酯可分为化学法和酶法两种。化学法虽然成本低，但污染大、设备要求高，回收利用率不高。刘志强等[2]研究菜籽油乙醇醇解，以正己烷为溶剂，以LVK脂肪酶催化反应，分三步添加乙醇，最终酯化率可达到93%。张振乾等[3]用自制脂肪酶催化菜籽油乙醇醇解反应，酯化率可达92.91%。Dalla等[4]用Novozym 435催化大豆油和乙醇反应，酯化率为85%。相对于化学法，用酶法催化红花油制备脂肪酸乙酯具有广阔的应用前景。固定化技术的发展有效降低了酶的使用成本，促进酶催化反应的工业化应用[5-6]。笔者团队制备的固定化酶成本比商品化酶低、稳定性高，能降低成本，有利于工业化生产。

脂肪酶(EC 3.1.1.3)又称三酰基甘油酰基水解酶，广泛存在于动植物和微生物中，且具有多种催化功能特性[8-9]。微生物来源的脂肪酶具有催化活性较高、多样性、便于基因操作、稳定性好和原料易得等优点，因此成为商品化脂肪酶的主要来源。脂肪酶能够在油-水界面进行催化，包括水相中催化酯水解反应，有机相中催化酯合成、酯交换等多种反应，在水相、微水相和两相催化体系中保持高活性、高稳定性、高区域选择性和高立体选择性，因此被广泛应用在油脂水解和改性、洗涤剂生产、造纸工业、皮革加工以及手性合成等领域[9-10]。笔者利用自制的固定化脂肪酶催化红花油乙醇醇解反应，对该催化反应的影响因素进行了系统的优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

固定化CandidaanatarcticB脂肪酶(Novozym 435)、固定化Rhizomucormiehei脂肪酶(Lipase RM IM)和Thermomyceslanuginosus脂肪酶(Lipase TL IM固定化酶和Lipozyme TL100L液体酶)，购自丹麦Novo Nordisk公司；固定化Burkholderiacepacia脂肪酶(Lipase PS IM)，购自日本Amano公司；红花油，购自嘉吉集团；大孔吸附树脂D101，购自郑州勤实科技有限公司；乙醇、石油醚(分析纯)，购自国药集团化学试剂有限公司。

台式恒温水浴摇床(HWY-2112)，上海智诚分析仪器制造有限公司；气相色谱仪(Agilent6890)，美国安捷伦科技公司；电子分析天平(B2-2FA2004)，上海世义精密仪器有限公司；气相质谱联用仪(7890A/5975C)，美国安捷伦公司；旋转蒸发仪(Hei-VAP)，德国Heidolph公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪酶的固定化方法

称取10 g吸去水分后的净品级大孔吸附树脂D101(已经过预处理，包括酸碱处理、乙醇浸泡和蒸馏水清洗)。取40 mL的脂肪酶酶液Lipozyme TL100L，装于50 mL锥形瓶中，密封。将称取好的树脂加入装有酶液的锥形瓶中，30 ℃水浴，摇床振荡速率150 r/min，固定反应5 h。吸附完成后加0.25%聚乙烯亚胺，混匀，继续30 ℃水浴，摇床振荡速率150 r/min，吸附交联固定1 h。用叔丁醇洗涤固定化酶，抽滤，45 ℃真空干燥得到固定化脂肪酶，密封保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 固定化酶催化红花油乙醇醇解反应

取10 mL离心管，加入0.8 mL的红花油，再分别加入乙醇0.4 mL和有机溶剂0.8 mL，称取0.016 g固定化脂肪酶，混合摇匀，置于恒温水浴摇床中反应3 h，转速200 r/min，反应结束后取出部分样品进行气相色谱检测。

1.2.3 气相色谱检测分析方法

采用气相色谱检测亚油酸乙酯含量。用移液器取酶催化反应液10 μL至气相样品瓶，再加入990 μL乙酸乙酯稀释后进行气相色谱检测。色谱柱为DB-23石英毛细管柱(60 m×0.32 mm×0.25 μm)，FID检测器；检测条件为柱温220 ℃，恒温保持10 min，进样温度250 ℃，检测器温度250 ℃，载气为高纯氮气，柱压107.27 kPa；尾吹气流量24.0 mL/min；分流比20∶1。

1.2.4 相对转化率计算

红花油化学碱法醇解反应的亚油酸乙酯气相色谱峰面积为S，酶催化反应3 h得到的峰面积为S1，亚油酸的相对转化率计算公式为

(1)

1.2.5 气质联用分析方法

GC-MS分析条件(Agilent 7890N/5975C)：气相色谱柱型号HP-5 MS，进样口温度250 ℃；进样量1 μL；分流比100∶1；柱流速1 mL/min；柱温箱温度起初100 ℃保持2 min，10 ℃/min 升温至250 ℃保持8 min；辅助加热区温度250 ℃；MS四极杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃。EI+轰击源，全扫描模式扫描，扫描质量范围30～500 amu，发射电流200 μA，电子能量70 eV。

2 结果与分析

2.1 固定化脂肪酶的筛选

笔者考察了不同商品化和自制固定化脂肪酶对红花油乙醇醇解反应的催化影响，反应条件如1.2.2所示，实验结果如图1所示。自制的固定化脂肪酶催化的相对转化率最高达到43.2%，催化转化率比Novozym 435和Lipozyme TL IM高出近1倍。因此对自制固定化脂肪酶催化红花油乙醇醇解反应条件进行进一步优化。

1—Novozym 435；2—Lipase TL IM；3—Lipase RM IM；4—Lipase PS IM；5—自制固定化酶。图1 固定化脂肪酶的筛选Fig.1 The screening of immobilized lipases

2.2 有机溶剂对转化率的影响

有机溶剂作为反应介质对底物的相对溶解度、酶的催化活性和稳定性有一定的影响，而酶的催化活性与溶剂的疏水性大小(LogP)有很大关系[11]。LogP在一定程度上可以作为溶剂极性的定量表达，LogP值越高，溶剂的疏水性越强，对酶催化的影响也越小[12]。为了确定最适反应介质，实验考察了甲苯(1)、二氯甲烷(2)、乙醚(3)、石油醚(4)、丙酮(5)、叔丁醇(6)、正己烷(7)和环己烷(8)等反应溶剂。实验结果如图2所示，石油醚作为反应溶剂时相对转化率最高，达到58.5%，故取石油醚作为反应溶剂进行后续实验。

图2 有机溶剂对酶催化红花油乙醇醇解的影响Fig.2 The effect of organic solvents on lipase catalyzed ethanolysis of safflower oil

2.3 反应温度对转化率的影响

由酶反应动力学得出温度升高反应速度加快[13]。但过高的温度会破坏酶的三级结构，从而降低反应速率，同时温度的改变对有机溶剂黏度的影响也会影响转化率。笔者考察了不同温度(30，35，40，45，50 ℃)对转化率的影响，实验结果如图3所示。随着温度升高，相对转化率增加，温度为45 ℃时转化率最高，达到73.3%，随后下降。这可能是由于温度影响石油醚的黏度和传质阻力导致的。因此选择45 ℃作为反应温度。

图3 反应温度对转化率的影响Fig.3 The effect of reaction temperature on conversion rate

2.4 乙醇添加量对转化率的影响

红花油的乙醇醇解反应本质上是酯交换反应，是一种可逆反应，所以醇油比的升高有利于正反应的发生，提高转化率。在红花油添加量不变的条件下改变乙醇添加量，对醇油体积比因素进行考察，实验结果如图4所示。随着醇油比的增加，相对转化率大幅提高，当醇油体积比为1∶4时，转化率最高达到79.5%，随后又慢慢降低。这可能由于乙醇极性变大造成SN2型亲核取代反应速率下降，影响转化率。此外乙醇量过多，影响了脂肪酸乙酯与甘油的分层效果，也影响后续的回收利用。

图4 乙醇添加量对转化率的影响Fig.4 The effect of the addition of ethanol on conversion rate

2.5 石油醚添加量对转化率的影响

石油醚的添加量对红花油乙醇醇解反应也有一定的影响。由图5可知：当石油醚与红花油的体积比增大时，相对转化率提高。但当体积比超过1时，转化率就显著下降，这可能是因为过量的石油醚阻碍了红花油与乙醇的接触，从而降低了转化率，所以最适的石油醚与红花油体积比为1∶1，此时转化率达到73.2%。

图5 石油醚添加量对醇解反应的影响Fig.5 The effect of the addition of organic solvent on ethanolysis reaction

2.6 酶添加量对转化率的影响

实验考察了酶质量浓度(20，25，30，35，40 g/L)对转化率的影响，实验结果如图6所示。酶质量浓度为20～35 g/L时，转化率逐渐升高，最高达到79.6%，这是由于酶活性中心没有饱和，所以酶质量浓度越高转化率越高；随后转化率降低，因为酶质量浓度过高，底物有限，导致催化效率降低。因此选择35 g/L作为酶的最适添加量。

图6 酶质量浓度对转化率的影响Fig.6 The effect of enzyme loading on conversion rate

2.7 酶催化反应的正交优化实验

选择以上对固定化脂肪酶催化红花油乙醇醇解反应有一定影响的因素进行正交实验，设计正交因素水平表，如表1所示。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

表2，3为不同组合的各因素对自制固定化酶催化红花油乙醇醇解反应的影响结果，通过对反应后红花油转化率的极差分析可知：4 个因素的影响显著性依次为乙醇添加量>酶量>溶剂添加量>温度，最优组合为A3B3C1D2，考虑到能耗，温度45 ℃和50 ℃的极差很接近，故选择A2B3C1D2，即温度45 ℃、乙醇与红花油体积比为1∶4、石油醚与红花油体积比为1∶2、酶质量浓度为35 g/L。通过实验验证，在此条件下相对转化率达到77.7%。

表2 正交试验结果分析Table 2 Analysis of orthogonal test results

2.8 酶催化醇解反应的时间曲线

通过单因素优化和正交实验得到最优的条件，考察了固定化脂肪酶催化红花油醇解反应的时间曲线，实验结果如图7所示。反应时间在0～18 h范围内，随着反应的进行，酶催化反应的相对转化率逐渐增大，18 h时达到最高，随后稍有减小。因此该反应条件下的最佳反应时间为18 h，此时相对转化率可达98.8%。

图7 酶催化反应时间曲线Fig.7 Time curve of enzyme catalytic reaction

2.9 气质联用分析酶催化产物

通过酶催化反应，按最优条件：固定化酶0.016 g，红花油0.8 mL，乙醇0.3 mL，石油醚0.8 mL，在45 ℃水浴中振荡18 h，反应后旋转蒸发去除下层甘油，取上层液体稀释100倍后进行气质联用分析，总离子流色谱图如图8所示。

图8 气质联用测定总离子流色谱图Fig.8 The determination of total ion chromatogram of fatty acid ethyl ester by GC/MS

通过质谱数据库软件NIST08检索化合物结构，根据丰度图峰面积比例计算不同脂肪酸乙酯的相对质量分数。由表4可知：红花油产物中含有5种脂肪酸乙酯，分别为棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、油酸乙酯、亚麻酸乙酯和硬脂酸乙酯，其中亚油酸乙酯相对质量分数最高，达68.5%。

表4 气质联用测定红花油酶催化产物中脂肪酸乙酯相对质量分数
Table 4 The analysis of determination of relative content of fatty acids in safflower oil by GC/MS

保留时间/min名称相对质量分数/%14.990棕榈酸乙酯8.9816.595亚油酸乙酯68.5016.636油酸乙酯14.2016.692亚麻酸乙酯2.0616.857硬脂酸乙酯7.34

3 结 论

利用自制的固定化脂肪酶催化红花油乙醇醇解反应，并与商品化脂肪酶催化反应的效果进行比较，相对转化率要高于Lipozyme TL IM 和Novozym 435。通过单因素实验和正交实验对反应条件进行优化，确定了最佳催化工艺条件：反应温度为45 ℃、红花油和乙醇体积为4∶1、红花油和石油醚体积比为2∶1、酶质量浓度为35 g/L、反应时间为18 h，在此条件下转化率达到98.8%。对两步反应后的红花油进行气质联用分析，发现红花油醇解产物中主要含有5种脂肪酸乙酯，亚油酸乙酯相对质量分数最高为68.5%，其次为油酸乙酯14.2%，按含量从大到小依次为棕榈酸乙酯、硬脂酸乙酯和亚麻酸乙酯。