胆碱能神经病理损伤阿尔茨海默病模型构建

李伟 (宜春学院体育学院，江西 宜春 336000)

阿尔茨海默病(AD)作为临床上最常见的老年神经病变性疾病，是一种以记忆力减退、判断能力和理解能力下降等为主要临床表现的退行性神经疾病。随增龄，其发病率逐年升高。AD病程缓慢且难以逆转，早期多见记忆力和思维能力的明显减退，随后表现为辨认能力缺失，如辨别方向障碍等，语言表达困难、生活自理能力丧失等病理特征，终会因感染等严重并发症导致死亡。其病理特征的改变常与大脑海马和皮层神经元丧失，胞内出现神经纤维缠结，胞外出现沉淀的老年斑等相关〔1〕。为更进一步探究和验证AD的发病机制，众多学者依据其发病的病理机制，构建了多种动物模型，如筛选带有认知和记忆严重缺失的个体为代表的衰老认知障碍动物和自然发病的老化痴呆鼠模型、实施转基因技术构建转基因AD动物模型、外因造成脑供血不足致脑损伤诱导的老年动物慢性脑缺血模型、依靠改变外界因素致长期慢性缺氧状态的AD模型，通过脑内注射β-淀粉样蛋白(Aβ)造模的AD动物模型及采用鹅膏蕈氨酸(IBO)致基底前脑神经元毒性损伤造AD模型、长期进行冈田软海绵酸(OA)脑室投递诱导动物记忆严重缺失，导致脑内Aβ淀粉样沉积斑块的AD模型、乙酰胆碱M受体阻断致痴呆动物模型、铝元素中毒AD模型等。其中以胆碱能神经损伤的病理改变机制进行的AD造模是当前研究的重要领域之一。乙酰胆碱(ACh)作为最早发现的神经递质，能合成乙酰胆碱并以ACh为神经递质的神经元称为胆碱能神经元，胆碱能神经元在中枢神经系统内的分布极为广泛，其在AD的病理机制研究中占据着极为重要的地位，扮演重要的角色〔2〕。作为慢性神经退行性病变的AD，其重要的病理特征之一就是胆碱能神经元的丢失，从相关研究结果来看，虽然在AD早期胆碱能神经元并未丢失，而是收缩丢掉其表型标记物或处于萎缩状态〔3,4〕。

1 AD模型病理特征及其模拟方法

1.1AD的胆碱能神经病理改变 AD的常见病理改变包括细胞外聚集的Aβ沉积形成老年斑块、细胞内高度磷酸化Tau蛋白所致的神经纤维缠结及前脑基底胆碱能神经元的显著丢失等，且三者之间有着密切的相互关系，比如AD患者脑内的Aβ可损害胆碱能神经元，引起ACh系统的病变〔5〕，而Aβ比例失衡，在脑内沉积形成老年斑，可激活小胶质细胞，引发炎症反应，损害线粒体诱发能量代谢障碍，氧自由基生成增多，诱发氧化应激损害，激活细胞凋亡途径，介导细胞凋亡，还能通过激活蛋白激酶，促进Tau蛋白异常磷酸化〔6〕。这些病理改变又会反作用促进Aβ生成增多导致异常沉积，进一步促使正反馈的级联放大效应，诱导神经元减少，5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺等的递质异常。

1.2Aβ注射模拟大鼠AD模型病理特征 Aβ是由40～42个氨基酸构成的多肽蛋白，是淀粉样前体蛋白(APP)的水解产物，疏水性强且易聚集。Aβ在脑组织内的异常代谢会致使脑组织细胞RNA、DNA及蛋白质、脂质的过氧化反应过程〔7〕，损害线粒体的功能〔8〕、增强氧化应激反应，促进Tau蛋白过度磷酸化，诱导神经元的凋亡；Aβ的异常沉积还能形成免疫原应激反应，激活非特异性的免疫反应介导神经元损伤，进而触发Aβ级联反应，诱发一系列的神经功能损害。因此，Aβ沉积与神经元损伤、认知障碍、记忆丧失等的程度高度相关，Markesbery〔9〕已经证实Aβ是诱发脑部神经细胞氧化应激及细胞凋亡的重要原因之一。研究证实，Aβ在脑组织的异常代谢和沉积是AD发病的重要环节〔10,11〕。在AD患者机体中有较强的神经毒性的游离Aβ单体或寡聚体，游离的Aβ单体主要通过损伤突触的离子通道影响突触的可塑性、葡萄糖载体参与能量代谢，诱导氧化应激损伤、扰乱Ca2+平衡等途径导致神经元的毒性变化，相比Aβ单体而言，聚集早期的寡聚体毒性最强〔12,13〕。老年斑是AD的又一重要的病理学改变，而Aβ是老年斑的主要成分。体外实验结果表明Aβ在较低浓度时便可产生神经毒性作用，脑内注射微量Aβ可诱导动物产生记忆缺损等行为学障碍，出现典型性病理特征的Aβ沉积，与AD的病理改变极为相似的。因此，采用海马内单点注射或多点注射是一种较好的AD动物模型〔14,15〕。

主要的研究以Alvarez等〔16〕、Nabeshima〔17〕分别用单侧或双侧海马注射Aβ28片段，或者内置微型渗透压泵进行大鼠脑室灌注Aβ，再经被动回避、水迷宫等行为学评定证实大鼠认知功能受损程度，结合海马与大脑前端皮层胆碱乙酰化酶活性的变化评价产生的持续性损害。研究发现Aβ注射后4 w内海马APP的表达显著增加，同时伴随有较为严重的认知功能损害，依此可证实Aβ过度沉积于AD的发病存在密切相关关系〔18〕。可见，Aβ注射可构建急性AD损伤模型，随之动物出现与AD患者相似的记忆功能障碍，病理检测有明显的Aβ沉积，可较好地复制了AD病理特征〔19〕。此方法能快速建模，学习记忆障碍显著，损害部位明确，病理学检查可见明显的海马脑区锥体细胞丢失〔20,21〕。但该模型存在的不足也很明显，比如在注射Aβ时，稍不注意，就会造成海马区域周围脑组织的局灶性穿透损伤，导致注射点周围聚集大量的Aβ难以弥散地分布至脑内，易引起局部Aβ沉积过度，诱发局灶性脑细胞损伤。同时，被造模动物自身也有Aβ的清除功能，虽然该模型病理表现有典型的Aβ沉积，但持续时间不长，难以体现神经纤维缠结等的病理改变。

1.3Tau蛋白磷酸化模型构建AD病理特征 正常情况下，在催化磷酸化反应的蛋白激酶和催化去磷酸化反应的蛋白磷酸酯酶的共同调节作用下Tau蛋白处于动态平衡。Tian等〔22〕对SD大鼠双侧基底核注射蛋白磷酸酯酶-2A的抑制剂OA，可诱导Tau蛋白的过度磷酸化，致使Meynert基底核呈现Tau蛋白ser199/202位点的高度磷酸化，使其空间记忆力显著下降，并伴随有非磷酸化蛋白的表达降低。Yin等〔23〕采用相同方法发现，非磷酸化Tau蛋白减少，大鼠的记忆力明显下降，Tau蛋白ser214、ser262、ser396等过度磷酸化。类似的研究还有Nelson等〔24〕把OA注射入大脑皮质，使其诱导产生扭曲的营养不良性神经突；Lee等〔25〕将OA注入大鼠海马背侧，发现双螺旋细丝与营养不良性神经毡模出现，APP免疫反应明显，微管蛋白-2降低；后又有学者注射OA于大鼠额叶皮质后，发现细胞周期蛋白B1的表达增强，Tau蛋白磷酸化增加，神经元有丝分裂样溃变严重〔26〕。Rosenmann等〔27〕采用神经性Tau蛋白免疫小鼠，诱导AD模型鼠组织病理学改变特征，复制出典型的神经纤维缠结和轴突的损害。但由于采取注射药物诱导Tau蛋白过度磷酸化的过程，因此只能体现Tau蛋白的病理表现，该模型多应用于Tau蛋白磷酸化机制研究或抗Tau蛋白磷酸化作为靶标研发新药物的应用研究，因此，该模型的局限性较为明显。

2 胆碱能神经损伤模拟AD病理损伤

伴随着近年来化学神经解剖学、认知神经科学和分子生物病理学等的发展，中枢胆碱能神经系统损伤在AD认知障碍中的作用日益受到重视。近年来的研究现已经证实AD患者脑组织和脑脊液中Ach酯酶和Ach转移酶的摄取、合成与释放功能的下降，影响患者记忆力，出现典型的认知功能障碍。因此，胆碱能系统的活性与人的学习记忆与认知活动过程密切相关。重症AD患者尸检结果也证实，患者基底前脑的胆碱能神经元丢失，致使AD的合成、储存与释放功能下降，导致其记忆与认知功能障碍〔28〕。也有学者早期发现，AD患者脑中老年斑和神经纤维缠结部位增加了以不对称结构存在的Ach受体(AchE)，其胶原样的尾部，进一步促进Aβ沉积，形成老年斑〔29〕。有学者提出AD发病的胆碱能学说，该模型的构建主要是依靠胆碱能学说为基础，以引起包括大脑新皮层、海马、中缝背核与基底核等在内的脑功能部位率先出现胆碱能神经元退变、胆碱能神经功能降低，诱发AD病理改变。

3 胆碱能神经损伤构建AD模型

3.1物理手段切断海马伞致胆碱能神经损伤进行AD造模 采用此手段进行AD造模是建立在AD认知功能障碍的胆碱能学说基础上，采用手术法切断大鼠海马伞致穹隆-海马伞断裂，引起动物空间定向和记忆障碍的同时，诱发胆碱能损伤模型〔30〕，造成大脑中枢神经元损伤。该模型可用于观察以胆碱能药物的药效学评价，或观察和开发新药物对神经功能损伤的修复作用，常可用于AD临床前药效学研究的重要模型。龙大宏等〔31〕通过免疫电镜和形态计量学分析和评价损伤左侧穹隆海马伞造成隔-海马胆碱能系统损害的老年鼠AD模型，损伤后1个月检测发现损伤侧齿状回分子层神经生长因子受体阳性突触前终末、突触后致密物和ACh转移酶阳性轴突终末面积和周长都有不同程度的缩小。按照相似原理，Miyamoto等〔32〕也通过电解损伤Meynert基底核(NBM)降低大脑皮质ACh含量，增加记忆障碍，降低认知功能。这类造模方法主要在20世纪的七八十年代比较常见，主要采取手术方法切断扣带束、海马伞、背穹隆等海马通路，损坏胆碱能神经纤维的传导功能，影响海马定向，增加其记忆障碍。该模型的优点表现在造模周期短，不足主要体现在脑组织中单胺氧化酶B活性未见显著升高，且手术定位困难，难以避免损伤邻近组织，因此，采用此方法进行造模的方式已被淘汰。

3.2化学药物致胆碱能损伤进行AD造模 采用化学药物方法复制AD胆碱能损伤的常见方法包括腹腔注射东莨菪碱及樟柳碱(胆碱能拮抗剂)、1-乙基-1(2-羟乙基)氯化氮丙啶及海人藻酸(KA)、鹅膏蕈氨酸、使君子酸(QUIS)、N-甲基-D-天冬氨酸等神经毒素，损害胆碱能神经元功能的同时，也影响非胆碱能神经元的功能。在这些致神经损伤的药物中，以IBO为首选，IBO能恒定地损害动物学习记忆有关的行为执行。相比于IBO和QUIS对基底前脑的损害来看，基底前脑细胞对KA的敏感性低，用量大，稍有不慎便会引起动物的不正常死亡，而且在导致基底前脑细胞损害的同时，也引起包括海马锥体细胞在内的其他部位的神经元死亡〔33,34〕。

3.2.1乙酰胆碱M受体阻断剂致AD动物模型 东莨菪碱作为胆碱能拮抗剂，能有效阻断大脑皮质中的Ach受体的结合位点，而Ach是神经系统重要的化学递质，在神经信号传导过程中起到重要的信使作用，由于其结合位点被阻断进而诱发胆碱能系统的功能障碍。付君〔35〕参考Ahmed等〔36〕、Kotani等〔37〕的方法采取腹腔注射氢溴酸东莨菪碱〔1.5 mg/(kg·d)，连续7 d〕的方法进行AD建模。第7天水迷宫试验后检测血液和脑组织发现AchE含量明显增高，胆碱乙酰基转移酶(ChAT)含量明显降低，说明造模效果明显。叶翠飞等〔38〕于每天试验前0.5 h对实验组动物进行腹腔注射给药东莨菪碱制剂，脑组织测试结果显示M受体结合力明显下降。有研究指出，东莨菪碱或樟柳碱急性注射模型难以出现AD的组织病理学改变，而AD作为一种进行性不可逆的神经系统疾病，采用此模型造模的突触后AchM受体未见明显减少。因此，此模型主要以造成受试认知功能障碍，对长时记忆功能及海马神经元结构无明显影响〔39〕，从病理上来看，尚缺乏AD特殊病理特征，且阻断是可逆的。

3.2.2IBO致AD大鼠模型 具有强烈神经兴奋毒性作用的IBO是一种谷氨酸受体激动剂，常与神经元树突或胞体上的N-甲基-D-天冬氨酸受体结合诱发神经元溃变性中毒损伤〔40〕。采用此方法造模时，常在大鼠脑立体定位后〔41〕，采用常规消毒大鼠头部皮肤后，在头部中线处，纵向1.0～2.0 cm切口。用10%过氧化氢擦拭，暴露大鼠前囟点，再用微量进样器的针头对准前囟，抽取1 μl IBO，待拔出三棱针后，将标尺移回到原定位点，继续向硬膜下移动8.2 mm。10 min内单侧匀速注射IBO 5 μg，留针5 min出针，对侧相同位置采用同样方法注射IBO5 μg。双侧注射药物后，取下大鼠，缝合大鼠头皮，酒精常规消毒。霍江涛等〔42,43〕选择4月龄的SD雄性小鼠，采用NBM位置注射KA构建AD实验模型。具体如下：首先采用1%的巴比妥钠(20 mg/kg体重)进行腹腔注射，用以麻醉，然后用脑立体定位仪将其固定，再在颅骨线处将皮肤剪开，确定NBM的位置后，在颅骨上钻出约1.0 mm的孔径，再在NBM的两侧用微量注射器注入1 μl的KA，为破坏该区域的胆碱能细胞，需要匀速缓慢注射，注射后并留针5 min，术后及时进行处理，不仅要缝合皮肤，且为避免感染，需要按时给予青霉素注射消炎，连续进行3 d。Ahmed等〔44〕将IBO微量注射入大鼠NBM后，发现该方法一方面造成大鼠被动逃避反应潜伏期缩短，另一方面组织学检查可见腹侧丘脑和小丘脑外侧区损毁，苍白球腹内侧核胆碱能神经元大部分消失，胶质细胞增生等病理症状。该造模方法属于兴奋性毒素致基底核损害模型，通过IBO注射常可导致反应学习记忆功能下降、基底前脑胆碱能神经元缺失等的病理学改变，虽然该类模型的缺陷是难以诱导产生AD的病理学特征，不能诱导出AD的病因，但广泛应用于胆碱能神经元损伤药物的筛选与药效研究。侯雪芹等〔45〕对比了氢溴酸东莨菪碱致记忆障碍模型、鹅膏蕈酸致痴呆大鼠模型、快速老化模型及双转基因小鼠模型进行对比，结果显示快速老化小鼠的Morris水迷宫测试、Bcl-2蛋白表达及凋亡检测较其他模型组更为明显，提示快速老化模型对于老年痴呆凋亡机制的研究优势明显，可为临床研究防治老年痴呆的新药开发提供指导。

3.2.3OA慢性损害进行AD造模 OA可特异性抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶，激活蛋白激酶(PK)C，一旦丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶受到抑制便可引起Tau蛋白过磷酸化，诱发神经纤维缠结的形成，引起慢性损害，诱导AD病理损伤，此方法可用于AD造模。因此，作为丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶特异性抑制剂，长期进行脑室投递，可引起动物记忆缺失，脑内出现神经纤维缠结样磷酸化Tau蛋白和Aβ沉积斑块。Arendt等〔46〕发现丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化酶的活性抑制、PKC激活均可刺激Aβ的生成，进而引起Aβ的沉积和神经纤维缠结的形成。正是由于OA的这一作用，可同时复制AD典型的病理改变神经纤维缠结和老年斑的形成，因此该模型具有明显的优势，比如通过该模型从Aβ和Tau蛋白代谢异常及二者相互作用诱导AD发病探究其病理机制。该模型的研究主要倾向于认知缺失与前脑胆碱能系统损伤模拟AD病理改变〔47〕。

3.2.4自身免疫抗胆碱能神经元损伤AD模型 成威〔48〕的研究结果显示AD患者血清与脑脊液中含有抗胆碱能神经元抗体，患者脑内存在炎症免疫反应，并在老年斑中发现了多种补体成分，可见该AD患者所患疾病为自身免疫性疾病。罗秀梅等〔49〕建立了大鼠侧脑室注射免疫毒素192-IgG-Saporin AD模型，Y迷宫检测和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶(NADPH-d)组织化学法染色分析结果显示，造模后的大鼠学习、记忆能力明显损害，基底前脑内侧隔核和斜角带垂直支一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元数明显减少，基底前脑的胆碱能细胞选择性地严重破坏，细胞周长和面积降低，灰度值升高等典型症状，进一步证实自身胆碱能神经元抗体诱导胆碱能神经元损伤的可能。

3.2.5其他化学方法致胆碱能神经损伤造AD模型 除了以上常用化学毒性药物进行胆碱能损伤造模以外，还有学者采用乙基胆碱氮芥丙啶(AF64A)、白喉毒素、免疫毒素192-IgG-Saporin等进行损害大脑胆碱能神经元进行AD造模。如Fisher等〔50〕发现AF64A可诱导大鼠大脑皮层与海马组织的胆碱能神经持续性损害，于是直接将AF64A注射入大鼠背侧海马，发现该方法引起的损伤与认知功能长期损害呈相同改变；也有研究在小脑室内注射AF64A，结果发现大脑皮层与海马组织内的高亲和力胆碱转运(HAChT)呈非竞争性最大速率的下降，而纹状体不受此干扰。Kudo等〔51〕也选择将白喉毒素与神经生长因子结合形成白喉-神经生长因子结合毒素，通过神经生长因子受体介导的入胞作用，输注入大鼠大脑皮质，避开非胆碱能神经元及周围神经纤维选择性损伤前脑基底核的胆碱能神经元。

综上，AD发病率呈逐年递增，且年轻化趋势明显，因此，针对AD发病机制的研究探索刻不容缓。ACh在调节突触的可塑性方面起关键作用，可参与调节海马及皮层的神经元活动，因此，针对胆碱能神经损伤类方法进行AD造模是一种病理模仿过程，在AD研究中占据重要的地位。但由于这类损伤胆碱能神经元AD模型，重点在于复制AD胆碱能功能减退和认知功能障碍、记忆功能损害为主要特征的病理性改变，但难以出现AD的典型性病理特征老年斑和神经纤维缠结。因此，该类造模方法常可用于评价药物对AD样胆碱能神经系统损害及其学习记忆与认知功能障碍的改善作用。