Gαi1/3对术后认知功能障碍小鼠学习记忆功能的影响

张玉凤 张浩 孙剑 (淮安市妇幼保健院麻醉科，江苏 淮安 223002)

术后认知功能障碍(POCD)是患者手术麻醉后出现的一种中枢神经系统并发症，主要表现为麻醉后患者记忆力，抽象思维及定向力障碍，并伴有社会活动能力减退，即人格、社交能力和认知能力的改变〔1〕。研究发现血清神经生长因子(NGF)水平与全麻手术患者POCD有关，有学者发现七氟烷能够降低宫颈癌及前列腺增生患者血清NGF水平,并对术后1 d认知功能造成一定影响〔2,3〕，丙泊酚麻醉同样影响患者术后血清NGF水平及简易智能状态检查量表评分〔4〕，这些研究均提示早期监测血清NGF水平有利于预测POCD的发生，而外源性给予NGF可显著影响脑神经退行性疾病的进展〔5,6〕，但具体分子机制尚不明确。

NGF与高亲和力受体酪氨酸基酶(Trk)A结合后能够抑制小胶质细胞下游炎症反应通路的激活〔7,8〕，可能是缓解POCD发展的重要机制。研究发现在表皮生长因子(EGF)和角质细胞生长因子(KGF)与受体结合后均会通过Gαi1/3激活招募Grb2相关结合蛋白(Gab 1)，具体机制主要是受体、Gαi1/3、Gab1形成复合物，从而介导下游信号通路的激活〔9,10〕。EGF受体(R)和KGFR都是具备酪氨酸激酶活性的细胞表面受体，与TrkA相似。因此猜测Gαi1/3同样能与TrkA受体及信号下游的Gab1结合，从而影响NGF的功能发挥，损伤小鼠的学习记忆功能。本文运用转基因技术抑制Gαi1/3的表达，观察其对小鼠海马区相关蛋白表达的影响，同时用避暗实验及水迷宫实验记录小鼠的学习记忆功能。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 清洁级健康C57/B6小鼠75只，6～7月龄，体重26～32 g，由扬州医学院动物实验中心提供。采用随机数字表法分为5组(n=15):C 组、P组，P1组、P2组和P3组。除C组外其余4组采取异氟烷吸入建立POCD模型。海马区立体定位注射P组慢病毒空载体，P1组慢病毒包裹的 Gαi1-shRNA，P2组慢病毒包裹的 Gαi3-shRNA，P3组慢病毒包裹的 Gαi1/3-shRNA，C组不进行药物及手术干预。

1.2小鼠POCD模型制备〔11〕采用异氟烷吸入制备小鼠 POCD 模型，选取成年 C57/B6 小鼠，经7 d适应环境后，持续吸入 1.5%异氟烷4 h，术后注意保暖待小鼠麻醉恢复翻正反射后放回笼子里各自饲养。

1.3避暗试验 避暗试验分为训练和正式试验两个阶段：训练前将小鼠头背着洞口放入明室，先适应环境 3 min，然后给暗室铜栅通以36 V电流，小鼠一进入暗室即受电击，其正确反应是回到明室，铜栅通电持续 5 min，此为训练过程。24 h后对小鼠进行记忆测验，记录小鼠第一次进入暗室的时间，此为避暗潜伏期。

1.4Morris 水迷宫试验 被动避暗试验结束后，开始Morris水迷宫试验，分为训练期、定向航行试验和空间搜索试验三部分进行。训练期：在定向航行试验前1 d，水池中不放置平台，使小鼠在水中自由游泳 2 min，使其适应环境。定向航行试验：进行定向航行试验时，将平台放在固定的第二象限。该试验训练小鼠每天 4 次，共5 d。训练时，将小鼠面向池壁从4个入水点分别放入水池，记录鼠入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间，作为潜伏期，并记录从小鼠入水至找到平台通过路径的总长度。小鼠找到平台后，让其在平台上站立30 s。若入水后60 s若小鼠仍未能找到平台，则将其轻轻从水中引导拖上平台，并停留30 s，然后进行下一次训练。每只鼠从4个入水点分别放入水池为1次训练，两次训练间隔2 min。空间搜索试验： 在定向航行试验结束后，即第6天，将平台撤去，使其在水中寻找原平台所在位置，共120 s，记录从小鼠第1次到达平台原来所在位置的时间，及穿越原平台的次数，来评价小鼠记忆重现的能力。

1.5Western印迹法检测海马区Gαi1、Gαi3蛋白表达水平 行为学实验结束后处死小鼠并取海马组织，加入预冷的放射免疫沉淀测定(RIPA)裂解缓冲液及0.1%的PMSF，冰上匀浆。匀浆后离心提取上清液，即海马组织总蛋白。用二喹啉甲酸(BCA)法测定各样品总蛋白浓度，以最低蛋白浓度为标准配成等浓度等体积的蛋白样品。以样本体积的1/4为标准加入5×蛋白上样缓冲液，摇匀后沸水煮10 min，-20℃保存待用。用湿式电转仪法，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离目的蛋白，将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入一抗Gαi1、Gαi3，4℃孵育过夜。第二天加二抗，室温孵育2 h，TBST洗10 min，重复3次，用碱性磷酸酯酶试剂盒显色，待晾干后扫描条带，采用Image J图像软件分析各蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与Tubulin灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

1.6统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，重复测量方差分析。

2 结 果

2.1小鼠海马区Gαi1和Gαi3蛋白表达 与C组和P组比较，P1组海马区Gαi1蛋白表达水平显著下降，P2组海马区Gαi3蛋白表达水平显著下降，P3组海马区Gαi1和Gαi3蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。见图1。

图1 各组海马组织Gαi3和Gαi3蛋白表达

2.2避暗实验结果 与C组比较，其他4组避暗潜伏期显著缩短(P<0.05);与P组比较，P1组和P2组避暗潜伏期无明显变化(P>0.05)，而P3组避暗潜伏期显著缩短(P<0.05)。见表1。

2.3定位航行实验 与C组比较，第3天及以后其他四组潜伏期显著延长(P<0.05);与P组比较，P1组和P2组潜伏期无明显变化(P>0.05)，而第4、5天P3组潜伏期显著延长(P<0.05)。见表1。

表1 各组避暗实验及Morris水迷宫定位航行结果比较

2.4空间探索实验 与C组比较，其他四组第1次到达原平台所在位置时间显著延长，穿越原平台次数显著减少(P<0.05);与P组比较，P1组和P2组第1次到达原平台所在位置时间及穿越原平台次数无显著差异(P>0.05)，而P3组第1次到达原平台所在位置时间显著延长，穿越原平台次数显著减少(P<0.05)。见表2。

表2 Morris 水迷宫空间探索实验结果

3 讨 论

G蛋白又称鸟嘌呤核苷酸蛋白，由α、β和γ亚单位构成的异源三聚体。G蛋白根据α亚单位功能命名包括Gαs、Gαi、Gαq、Gα12，其中Gαi是成员最多的一种G蛋白〔12〕。Gαi又分为Gαi1、Gαi2、Gαi3、GαiO和Gαit等〔13〕。传统观点认为 Gαi 蛋白只和 G 蛋白耦联受体(GPCR)结合〔14,15〕。而最近研究发现Gαi 蛋白通过耦联并激活下游接头蛋白 Gab1介导脑源性神经营养因子(BDNF)-TrkB信号通路转导〔16〕。NGF与BDNF同属于神经营养因子，是神经系统重要的生长因子。NGF 主要有两种膜表面受体，即TrkA和神经营养素受体 p75(p75)。TrkA 识别并结合 NGF 后，发挥抑制细胞凋亡，诱导细胞存活、增殖和分化的作用〔17〕。本研究说明Gαi1和Gαi3在NGF-TrkA信号通路中可能发挥着相似或相同的生物学效应。

综上，同时抑制海马区Gαi1和Gαi3蛋白表达可以加重POCD小鼠认知功能障碍，而单独抑制Gαi1或Gαi3对POCD小鼠认知功能无明显改变。