免疫球蛋白重轻链检测在浆细胞疾病中的应用进展

马成成 王 鑫 高 英 香 雪 胡婉丽 柴 晔

(兰州大学第二医院血液科，兰州 730030)

浆细胞疾病以分泌单克隆免疫球蛋白(monoclonal immunoglobulin,MIg)为特征，具有高度异质性。MIg是指浆细胞或B淋巴细胞过度增殖产生的免疫球蛋白分子或片段,临床常见于意义未明的单克隆免疫球蛋白血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)、原发性巨球蛋白血症(macroglobulinemia，WM)、原发性淀粉样变(amyloidosis，AL)及POEMS综合征。MIg的检测主要依赖骨髓穿刺样本分析，传统的检测方法包括血清蛋白电泳(serum protein electrophoresis，SPE)、免疫固定电泳(immunofixation electrophoresis，IFE)，血清游离轻链(serum free light chain，sFLC)[1]。SPE对于低浓度MIg难以精确定量，IFE只能定性MIg,sFLC仅能间接反映浆细胞克隆程度，这些方法都难以精确检测微小残留(minimal residual disease，MRD)，MRD的精确检测是通过检测骨髓穿刺标本实现的，但常常由于骨髓病灶分布不均及骨髓稀释而导致检测结果差异较大[2]。血清重轻链(heavy/light chain，HLC)检测优势在于依靠外周血样本分析，具有敏感度高、获取简便、分布均匀、能直接反映浆细胞克隆程度等，但HLC检测技术并未广泛应用于临床，只有部分科研机构进行临床研究。本文就HLC检测推算出的HLC比值及“HLC对抑制”对于浆细胞疾病的早期诊断、危险分层、疗效评估、疾病监测、判断预后及治疗方面的潜在价值进行综述。

1 HLC检测方法

2009年Bradwell[3]首次提出HLC检测方法，该方法通过定量重链及轻链确定的完整免疫球蛋白(比如IgGκ、IgGλ、IgAκ、IgAλ)水平，推算出受累免疫球蛋白与非受累免疫球蛋白的比值，即HLC比值(IgGκ/IgGλ，IgAκ/IgAλ)[4]。HLC检测的原理是特异性识别被隐藏起来的重链与轻链相结合时的隐藏区表位，检测分两部分，以IgGκ型蛋白血症为例，第一部分为IgGκ，第二部分检测为IgGλ，在IgGκ和IgGλ中，升高的一个即为受累重轻链，另一个则为非受累重轻链(正常IgG)，二者差值绝对值即为单克隆IgG，亦即M蛋白。具体操作为通过免疫，聚合，吸附等一系列程序，采用绵羊抗体分别识别6种分子：IgGκ、IgGλ、IgAκ、IgAλ、IgMκ、IgMλ，抗体靶点作用于重链和轻链之间的表位，使用免疫比浊法定量免疫球蛋白。IgG、IgA、IgM的参考范围参照梅奥诊所实验室参数[5]，HLC检测操作方便，其检测试剂盒(IgGκ/λ、IgAκ/λ)均购自英国The Binding site公司。患者血清经过采集、离心、分装、保存备用，采用免疫比浊法定量检测rHLC(IgGκ/λ、IgAκ/λ比值)。尽管SPE技术已经有很大进步，但在M蛋白鉴别和定量上仍存在问题，当M蛋白与其他血清蛋白比如转铁蛋白、补体等共同迁移时在电泳条带上表现为从α2区移动到γ条带，此时难以鉴别M蛋白；如果M蛋白浓度低或合并感染时会表现出多克隆征象，此时M蛋白可能无法分解为一个单独的条带。IFE是一种较为灵敏的检测方法，也是目前检测和表征M蛋白的金标准,国际骨髓瘤工作组(International Myeloma Working Group ，IMWG)建议用比浊法定量总Ig，但该方法不能区分MIg和正常的多克隆Ig。有报道SPE测定M蛋白浓度偏高，尤其是在IgG和IgM型M蛋白血症中[6]。HLC比值异常与患者无进展生存期(progression-free survival，PFS)和总体生存期(overall survival，OS)相关，在临床上可参考HLC比值来监测疾病进展及早期预测疾病复发[7-10]。

2 HLC比值及“HLC对抑制”在MGUS和冒烟型骨髓瘤(SMM)中的应用

2.1MGUS和MM疾病特征 MGUS和SMM是一种癌前克隆病变，MGUS的MIg<30 g/L,骨髓浆细胞比例低于10%，并且无CRAB症状，也称骨髓瘤癌前病变，肿瘤负荷相对较低。目前认为所有的MM患者由MGUS或SMM进展而来，尽管这些疾病存在重叠，但因各自生物学和疾病演变特征不同而被鉴别。2014年欧洲骨髓瘤网络(European Myeloma Network,EMN)提到MGUS每年恶变风险为1%，低风险的MGUS患者20年内进展为MM风险为5%[11]。SMM介于MGUS与MM之间的阶段，骨髓浆细胞>10%和/或MIg>30 g/L,但是无CRAB症状，比MGUS进展风险大，并且在确诊后5年内进展为MM风险是10%。MIg的定量对于MGUS和SMM患者疾病进展风险预测具有重要意义[12]。由于MGUS和SMM中的MIg浓度相对较低，HLC检测可以弥补电泳技术的不足，精确测定MIg浓度，评估疾病风险。HLC检测方法的出现，使得研究者对HLC比值及“HLC对抑制”在MGUS和SMM疾病进展的预测方面进行了深入探讨。

2.2HLC比值及“HLC对抑制” 受累与非受累的免疫球蛋白组成一对HLC对(HLC matched-pair)，受累的免疫球蛋白会抑制非受累的免疫球蛋白，这种现象称为“HLC对抑制”(HLC matched-pair supression)[13]。在IgA或IgM亚型中，“HLC对抑制”明显缩短患者的PFS，而IgM患者的“HLC对抑制”和演变模式与疾病进展独立相关[14]，这表明“HLC对抑制”有助于MGUS和SMM患者疾病危险分层，尤其是在IgG亚型患者中，虽然HLC检测还未常规应用于临床，但IgA MGUS患者97%的敏感性表明，几乎所有的MGUS患者都可使用HLC检测克隆性和定量[15，16]。值得注意的是，在不同重链亚型中HLC异常比例不同，可能是由于IgG型MIg参数范围下限比IgA和IgM浓度高所致[17]。Katzman等[5]发现，999例MGUS患者中，66%患者HLC比值异常，其中IgG型、IgA型和IgM型MGUS中HLC比值异常比例分别为56%、96%、90%，即使是在很低的MIg浓度，HLC比值仍会出现异常，多变量分析HLC比值在MGUS中敏感性高，对于MGUS诊断意义不显著，并且多因素分析显示HLC比值异常对于MGUS疾病进展无显著意义，但“HLC对抑制”能够反映单克隆浆细胞对多克隆浆细胞的抑制程度，且是MGUS患者疾病进展的独立危险因素[5]。关于MGUS危险分层的研究，根据初诊时包含危险因素的个数将患者分为5个亚组，发现各亚组之间其疾病进展风险差异显著，并通过构建危险分层模型，证实有助于早期识别高危患者，从而制定个体化治疗方案并长期随访。与单纯的MIg定量相比，“HLC对抑制”更能鉴别高危MGUS患者，是疾病危险分层、判断预后的因素之一。

MGUS、SMM进展为MM的危险因素为MIg浓度、浆细胞比例、Ig重链分型、sFLC比值、尿克隆轻链、未受累的多克隆Ig[18]，“HLC对抑制”反映的是MIg对多克隆Ig的抑制，因此HLC抑制程度可根据轻、中、重度进行疾病危险分层，预测MGUS或SMM进展风险，识别高危患者并对这部分患者密切随访，直至疾病进展，并且选择合适的治疗方案及干预时间，最终延长患者的PFS及OS。

3 HLC比值及“HLC对抑制”在MM中的应用

3.1MM疾病特征 MM是浆细胞恶性增殖性疾病，以血或尿中出现单克隆免疫球蛋白为特征。MM的诊断基于MIg浓度，MM的疗效评估是基于血清和尿蛋白电泳中MIg的减少水平，2016年IMWG已经新增了MRD作为MM疗效评判的标准。随着新药及自体造血干细胞移植(autologous stem cell transplantation，ASCT)的应用，MM的预后明显改善，但仍无法治愈。MM患者获得完全缓解(complete response，CR)并不能明显改善预后，但持续MRD阴性患者的PFS和OS都要优于MRD未转阴患者。SPE检测时，在46%的IgA型和4%的IgG型MM患者中，MIg常迁移至SPE的其他条带区域，被转铁蛋白、β脂蛋白及C3浓度影响,而HLC检测可克服传统检测方法的不足，精确测定低浓度的MIg，还可鉴别受累的免疫球蛋白及未受累的免疫球蛋白，同时，HLC比值异常提示单克隆性，受累的HLC(involved HLC，iHLC)为M蛋白定量提供依据，能够精确反映肿瘤负荷，并且总IgG HLC(IgGκ+IgGλ)与总IgG(total IgG)定量一致,有望为治疗后评估疗效提供一个更精确的MIg测定。

3.2HLC比值 大部分患者的SPE与HLC比值具有良好的一致性，但部分SPE阳性患者的HLC比值却表现为正常[19，20]，考虑HLC检测IgG型MIg敏感性比IgA、IgM低，除此之外，还与MM患者在治疗期间出现新的克隆(IgGκ治疗后出现IgGλ)或MM患者为不同亚型的双克隆有关，若sFLC比值增加，则考虑治疗过程中可能出现轻链逃逸，结果疾病进展或复发，这表明当怀疑临床复发时sFLC与HLC联合应用对监测MM复发的重要性。反之，在完全缓解的MM患者中，SPE、IFE、sFLC均正常，但HLC比值异常，表明MM患者仍存在MRD[21，22]。通过动态监测同一MM患者的HLC比值变化，发现HLC比值恢复正常的时间迟于传统检测方法，因此HLC检测MRD较敏感，可作为MM患者MRD的辅助评价方法[23]。新诊断的MM患者诱导治疗后，80%的患者HLC正常，且联合sFLC和HLC测定检测MRD阴性比例与单独HLC检测结果相当，但后者更容易实行[24]，且HLC联合IFE、sFLC敏感性比单独检测方法敏感性更高，通过多种方法检测MIg的敏感性时，sFLC比值正常的患者可出现HLC比值异常，HLC比值异常患者复发率较高[25]，除此以外，HLC比值与β-2微球蛋白被认为与预后相关，通过风险分层模型分析，发现β-2微球蛋白大于3.5 mg/L和HLC比值异常的患者预后较差，比ISS分期具有更高价值[7]。HLC比值变化反映疾病进程，为MM患者的疗效评估、治疗选择及预后提供重要的参数，尤其是IgG型多发性骨髓瘤患者化疗后HLC比值异常会缩短无进展生存期[20]。

3.3“HLC对抑制” “HLC对抑制”驱动致HLC比值异常，与治疗后肿瘤活性及多克隆免疫重建有关。“HLC对抑制”在新诊断的MM、复发难治性MM及ASCT患者中都提示不良预后。在新诊断的MM患者中，存在“HLC对抑制”的MM患者总体生存时间明显缩短,尤其是在IgG型MM患者中[26，27]。“HLC对抑制”在未达到VGPR的患者中抑制程度显著，即使患者能够达到首次缓解，但仍影响患者PFS。Ludwig等[28]采用多变量分析证实显著的“HLC对抑制”可作为缩短OS的独立危险因素，提示特异性免疫失调会影响MM患者的OS，值得注意的是，在复发难治性MM患者中，也得出相同结论。对于进行ASCT的MM患者，“HLC对抑制”反映了克隆细胞的持续存在，而与全身的免疫缺陷无关[29，30]。在疗效评估方面，根据“HLC对抑制”程度对MM患者分层，MIg浓度越高，“HLC对抑制”程度越高，PFS越短。根据IMWG的评估标准，部分疗效评估为VGPR的患者，在HLC评估标准中却为CR，但是这两种方法评估为CR的患者PFS相似，说明HLC评估并未破坏传统评估的有效性。

在达到深度缓解时(IFE阴性、sFLC正常)，HLC比值及“HLC对抑制”的价值在于提高了MRD检测的敏感性，是缩短PFS、OS的危险因素，HLC检测方法进行疗效评估与传统检测方法结果相似，但是在获得更深程度缓解的患者中HLC检测比IFE更敏感[8]，HLC可能是评估CR的一个更合适的工具。而“HLC对抑制”与机体免疫重建相关。相反，当IFE阴性，SPE、HLC正常时，在骨髓活检前我们还应该检测sFLC，明确有无轻链逃逸或其他亚克隆的发生，避免不必要的有创性检查，HLC与sFLC不一致时，更加说明了MM疾病的异质性，在MM病程中发生克隆演化，出现亚克隆，产生了完整Ig。

4 HLC比值及“HLC对抑制”在WM中的应用

4.1WM疾病特征 WM是一种淋巴浆细胞淋巴瘤，其特征是骨髓中存在浆细胞样淋巴细胞浸润，并伴有外周血单克隆免疫球蛋白M(IgM)增高。单克隆IgM与肿瘤负荷相关，并且是WM疗效评估、疾病进展的重要血清学指标。IgM在血清中易形成相对分子质量较大的多聚体，导致凝胶孔堵塞，影响单克隆IgM测定水平，而传统方法对低浓度IgM敏感性差，不能精确反映肿瘤负荷程度，另有一些样本含有冷球蛋白，需要高温下才能分析，以防单克隆IgM的沉淀，传统方法面临挑战，HLC检测提高了IgM敏感性。

4.2HLC比值 Boyle等[31]比较了HLC、SPE和浊度计测定三种方法对于WM诊断的敏感性及疗效评估的差异，结果显示，在所有检测的WM血清中，IgM HLC比值均异常。尽管定量在三种方法中并不一致，但HLC检测评估的疾病分层与国际指南评估一致。HLC检测为传统实验室定量单克隆IgM提供了一种替代方法，从而能更好用于WM患者的管理[32]。国内曾报道过一例双M蛋白血症的WM患者，报告中提及HLC比值异常与免疫球蛋白克隆性相关，尤其是2种单克隆M蛋白电泳条带完全重叠时，HLC检测仍然可用于初步诊断[33]。

4.3“HLC对抑制” 因为WM患者的IgM含量较MGUS高，所以“HLC对抑制”对多克隆免疫球蛋白抑制程度也较严重，且与疾病克隆程度一致。HLC检测对于双克隆MIg具有诊断价值，能精确定量IgM，“HLC对抑制”与疾病克隆相关，未来对于疾病进展预测及预后判断具有一定临床价值，有可能作为当前检测方法的补充或取代目前的M蛋白测定技术，但仍需更多前瞻性临床试验证实。HLC检测对于大部分WM患者敏感性高，特异性相对较差。另外，对于高浓度的单克隆IgM,HLC检测方法是否优于传统方法仍没有确凿证据证明。

5 HLC比值及“HLC对抑制”在AL中的应用

5.1AL疾病特征 AL又称免疫球蛋白轻链淀粉样变性(immunoglobulin light-chain amyloidosis)，其特征是骨髓克隆性浆细胞过度产生免疫球蛋白轻链(κ或λ)，聚集并沉积到组织或器官形成淀粉样变性。AL淀粉样变性中，血清游离轻链即为MIg。目前AL疾病主要是通过sFLC检测κ和λ轻链监测M蛋白。研究表明，sFLC测定对于轻链型AL淀粉样变性诊断及预后具有重要意义[34],无论是在化疗还是移植患者中，是sFLC而不是完整的MIg决定了AL患者对治疗的反应，从而影响患者的生存期，梅奥研究组也有类似报道[35]。

5.2HLC比值与“HLC对抑制” 在AL患者中HLC比值异常很少见，但是“HLC对抑制”的程度的与预后相关。2016年的一项研究所纳入的199例未经治疗的AL患者中，HLC异常患者占37.2%，sFLC异常患者占81.9%，HLC与sFLC结合敏感度为100%[36]。结论显示，sFLC异常提示OS缩短，但HLC却与OS无明显相关性，在sFLC结果正常的患者中，HLC检测有可能作为补充试验来定量单克隆蛋白。另有研究表明，严重的“HLC对抑制”是心脏AL患者预后不良的因素，也是自诊断后生存期超过6个月的有效标志[37]。

AL发病机制决定了sFLC对于该疾病的预后价值，因此未来sFLC与HLC检测方法联合可增强AL患者疾病监测的敏感性；“HLC对抑制”在AL中的意义仍需在未来更多的纵向研究中验证，需在使用新药治疗的更多患者中证实。

6 HLC比值及“HLC对抑制”在POEMS综合征中的应用

6.1POEMS疾病特征 POEMS(polyneuropathy,organomegaly,endocrinopathy,monoclonal plasma cell disorder,and skin changes)是一种罕见的浆细胞增多的副瘤综合征，其特征主要是：多发性周围神经病变、脏器肿大、内分泌病变、 单克隆性浆细胞疾病和皮肤改变，并由此而得名。该疾病中单克隆蛋白的血清浓度通常较低，并且在大多数情况下不适用于监测疾病活动，限制了其预后价值。

6.2HLC比值 目前HLC检测的出现对于浆细胞疾病的监测和预后评估具有一定优势。2016年的一项纳入了90例POEMS患者的研究，分别测定了基线HLC及治疗后的HLC比值，其中有66%的患者基线HLC比值异常[37],治疗后HLC有所改善，但仍有48%异常[38]。该研究表明，基线HLC异常或治疗后HLC比值异常都是不良预后的独立危险因素。因此，HLC在POEMS综合征的临床诊治当中具有一定的预后价值。

“HLC对抑制”在POEMS中暂无相关研究报道。POEMS综合征MIg浓度相对较低，HLC对于低浓度MIg敏感性高，因此HLC检测方法精确定量MIg，对POEMS综合征诊断、监测疾病活动及评估疗效具有重要价值。

7 总结与展望

M蛋白是浆细胞疾病诊断、疗效评估、预后评价的核心指标。HLC检测为M蛋白精确定量、评估疾病克隆程度及微小残留病灶监测带来了新的契机。同时HLC比值及“HLC对抑制”对于疾病进展、预后分层及早期预测疾病复发具有重要意义。近年来，HLC比值及“HLC对抑制”在MM中的研究较多，与MM发病率、病例数较多、容易复发有关，目前MM患者预后追求MRD持续阴性，因此，HLC比值及“HLC对抑制”在MRD方面的研究较多，但仍存在一定的局限性，需要更多的研究来验证。