CD103和E-钙黏蛋白在结肠癌组织中表达及作用研究①

粟 虹 韩云雪 佐 妍

(桂林医学院附属医院综合科，桂林 541001)

结直肠癌是全球第四大常见癌症，其整体5年生存率约为50%[1]。除了肿瘤的病理分期，组织学亚型和外科手术程度外，手术切除的肿瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)的存在也与良好的预后显著相关[2]。比如CD8+TIL在几种恶性肿瘤中的积累已被证明与患者良好的预后相关[3,4]。新近报道表明，ITGAE(integrin，alpha E)也称为CD103，在抗癌免疫中起着至关重要的作用。例如，ITGAE可以通过肺癌和宫颈癌中的细胞毒性T细胞识别异常细胞，杀伤肿瘤细胞[5-7]。上皮组织中的钙黏蛋白称为E-钙黏蛋白，是一种Ca2+依赖的细胞黏着糖蛋白，在维持细胞形态和黏附中发挥重要作用。E-钙黏蛋白功能异常将导致多种恶性肿瘤的发生发展[8]。本研究检测了45例结肠癌组织中CD103和E-钙黏蛋白的表达水平，并在体外实验探究CD103和E-钙黏蛋白表达变化对肿瘤活性的影响。

1 材料与方法

1.1材料 选取2018～2019年于我院进行结肠癌手术的45例标本，均未进行化疗和放疗。38例正常结肠组织标本中有18例为癌旁组织，并经病理证明为正常组织，20例取自良性疾病结肠部分切除标本。结肠癌45例样本中男性27例，女性18例。年龄 48～72岁，平均年龄(61.5±6.5)岁。肿瘤分化程度：高中分化21例，低分化24例，伴淋巴转移19例，无淋巴转移26例。TNM分期：Ⅰ-Ⅱ期23例，Ⅲ-Ⅳ期22例。兔抗CD103抗体(Sigma)，鼠抗E-cadherin抗体和鼠抗GAPDH抗体(Proteintech)。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR(real-time PCR，qRT-PCR) Trizol法提取结肠癌组织中总RNA。使用紫外分光光度计测RNA浓度。根据逆转录试剂盒说明，将RNA逆转录为cDNA，采用qRT-PCR检测结肠癌组织中CD103和E-钙黏蛋白的表达。所用引物：以 GAPDH 为内参， 上游引物:5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，下游引物:5′-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3′；E-钙黏蛋白引物:上游引物： 5′-TCATGAGTGTCCCCCGGTAT-3′，下游引物：5′-TCTTGAAGCGATTGCCCCAT-3′；CD103引物：上游引物：5′-CAAGAGGTCATCTGCTCATGT-3′，下游引物：5′-GGACAGAACTGCAACGAAGC-3′。

1.2.2肿瘤浸润淋巴细胞的分离 根据文献[9,10]中介绍的方法，分离结肠癌组织中浸润淋巴细胞。无菌操作取得结肠癌组织。PBS清洗结肠癌组织，置于培养皿中，加入8倍体积胰酶消化3 h。剪碎结肠癌组织，并于37℃水浴中孵育1 h，充分消化结肠癌组织，吹打混匀，过滤，收集单细胞悬液于50 ml离心管中，冰上放置10 min。50 g离心2 min。取上清于另一离心管中，400 g离心5 min。弃上清，加入3 ml胰酶重悬沉淀。加入密度梯度离心液，500 g离心20 min，加速9减速4。收集云雾层细胞，加入3 ml胰酶消化液重悬。再加入红细胞裂解液2 ml，处理5 min，加入2 ml PBS终止孵育，400 g离心5 min，弃上清，得到肿瘤浸润细胞，PBS洗涤细胞2次，用含10%血清的DMEM重悬细胞进行培养。

1.2.3质粒转染 TIL在实验前转染CD103过表达质粒(CD103 ACT)(Santacruz),转染了CD103 ACT质粒的TIL细胞记为TIL CD103+，SW480细胞转染E-钙黏蛋白敲低质粒(siCDH1)(Invitrogen)记为SW480 siCDH1。

1.2.4体外杀瘤活性测定 将培养的肿瘤浸润细胞作为效应细胞，SW480作为靶细胞，采用效靶比20∶1在96孔板中混合培养，CCK8检测SW480细胞存活比率，评价肿瘤浸润细胞杀伤癌细胞能力。实验分组：①CD103对TIL肿瘤杀伤活性的影响：SW480与普通TIL共培养(SW480+TIL)，SW480与过表达CD103后的TIL共培养(SW480+TIL CD103+)；②E-钙黏蛋白对CD103+TIL肿瘤杀伤活性的影响：SW480与普通TIL共培养(SW480+TIL)，SW480与过表达CD103后的TIL共培养(SW480+TIL CD103+)，SW480细胞敲低E-钙连蛋白后与普通TIL共培养(SW480 siCDH1+TIL)，SW480细胞敲低E-钙黏蛋白后与过表达CD103后的TILTIL共培养(SW480 siCDH1+TIL CD103+)。细胞存活率=实验组吸光度值/空白对照组吸光度值×100%。

1.2.5Transwell体外细胞侵袭实验 Transwell小室PVDF膜上预先铺上基质胶，37℃平衡2 h。PBS清洗1遍，放入24孔板内，每孔预先加入600 μl培养基，在Transwell 内室加入400 μl细胞悬液，培养箱中培养12～18 h。用棉签擦去靠近内室一侧的细胞，另一面用甲醛室温固定30 min，结晶紫染色20 min，PBS洗3遍，显微镜下观察细胞，计数。每组设3复孔。

1.2.6Western blot 收集组织样本，冰上使用RIPA裂解液裂解组织。BCA法进行蛋白定量，加入上样缓冲液稀释并在100℃水浴5 min。采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转印至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h。加入一抗(1∶1 000),4℃孵育过夜。用TBST洗3次，每次15 min，室温孵育二抗(1∶2 000)2 h，TBST洗涤后用化学发光显色法显影，拍照统计。

1.3统计学分析 所有数据采用SPSS11.5软件包进行分析。各组数据的比较依据资料的性质，采用t检验或方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1结肠癌组织及正常结肠组织中CD103和E-钙黏蛋白表达情况 结肠癌组织中CD103与E-钙黏蛋白的表达情况采用RT-PCR和Western blot检测，结果如图1、2所示，与正常组织相比E-钙黏蛋白在结肠癌组织中表达降低(P<0.001)，CD103 表达增加(P<0.001)。

图1 结肠癌组织及正常结肠组织中CD103和E-钙黏蛋白表达情况Fig.1 Expressions of CD103 and E-cadherin in colon cancer tissues and normal colon tissuesNote:Compared with normal tissues,***.P<0.001.

2.2CD103、E-钙黏蛋白与结肠癌临床病理特征的关系 结果图3所示，E-钙黏蛋白表达与结肠癌有无淋巴结转移、临床分期以及分化程度有关，与无淋巴结转移患者相比，淋巴转移患者中E-钙黏蛋白表达更低；临床分期Ⅲ-Ⅳ期以及低分化患者中E-钙黏蛋白表达更低(P<0.001)。CD103 表达与结肠癌的临床分期及分化程度有关，在Ⅲ-Ⅳ期以及低分化患者中CD103表达更低(P<0.001)；与无淋巴结转移患者相比，淋巴结转移患者中CD103表达降低，但没有统计意义(P>0.05)。

图3 CD103、E-钙黏蛋白与结肠癌临床病理特征关系Fig.3 Correlation of CD103,E-cadherin and clinicopa-thological features of colon cancerNote:Compared with no lymphatic metastasis,ns.P>0.05,***.P<0.001;compared with Ⅰ-Ⅱ stage,*.P<0.05,***.P<0.001;Compared with G1-G2 stage,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3E-钙黏蛋白对结肠癌细胞侵袭能力的影响 在结肠癌细胞SW480中敲低E-钙黏蛋白的表达进行Transwell 体外细胞侵袭实验，E-钙黏蛋白敲低的SW480细胞(SW480 siCDH1)穿过Transwell 的数目(177±18)明显高于对照组(SW480)穿过的数目(107±21)。

图2 Western blot检测结肠癌组织及正常结肠组织中CD103和E-钙黏蛋白的表达Fig.2 Expression of CD103 and E-cadherin in colon cancer tissues and normal colon tissues were determined by Western blot

2.4CD103对TIL肿瘤杀伤活性的影响 结肠癌组织中分离出的TIL过表达CD103后，与普通TIL相比，对结肠癌细胞SW480的杀伤活性显著提高，SW480细胞存活减少(P<0.001)。结果见图4。

图4 CD103对TIL肿瘤杀伤活性的影响Fig.4 Effect of CD103 on TIL tumor killing activityNote:Compared with TIL，***.P<0.001.

2.5CD103+TIL依赖E-钙黏蛋白发挥对结肠癌细胞杀伤作用 结果如图5，敲低SW480细胞中E-钙黏蛋白的表达后，TIL以及CD103+TIL对SW480杀伤活性降低，SW480细胞存活增加(P<0.001)；并且TIL和CD103+TIL对E-钙黏蛋白敲低的SW480细胞(SW480siCDH1)的杀伤活性没有显著差异。

图5 CD103+TIL依赖E-钙黏蛋白发挥对结肠癌细胞杀伤作用Fig.5 CD103+TIL relies on E-cadherin to kill colon cancer cellsNote:Compared with SW480+TIL,**.P<0.01,***.P<0.001;compared with SW480+TILCD103+,###.P<0.001.

3 讨论

CD103是一种介导上皮组织中淋巴细胞保留的整合素，并被认为是肿瘤浸润淋巴细胞的表面分子标志物[11]。调节性T细胞(Treg)通过与效应T细胞相互调节而维持免疫稳态[12]。然而，Treg细胞在肿瘤微环境中被重新编程，抑制抗恶性肿瘤的免疫反应，从而促进癌症发展[13]。研究人员发现CD103+TIL比CD103negTIL更强烈地抑制Treg细胞的活化，因此，CD103被认为是选择性消除肿瘤浸润性Treg的有趣目标，这种策略可能有助于抗癌疗法的改善[11]。本研究结果显示，与正常组织相比，CD103在结肠癌组织中表达升高，并且与肿瘤的恶性程度有关，在Ⅲ-Ⅳ期以及低分化患者中CD103表达更低(P<0.001)，表明随着病情恶化，CD103+TIL对肿瘤免疫应答的调节能力减弱，这可能是肿瘤恶化的一个原因。另一方面，虽然CD103在伴淋巴结转移患者中表达降低与无淋巴结转移患者相比没有显著差异，但的确存在降低的趋势，这可能与样本例数较少有关。最近的研究表明，CD103+淋巴细胞是结直肠癌微环境的重要组成部分，并与患者生存率呈正相关[14]。此与本研究所得结论一致。

E-钙黏蛋白是由CDH1基因编码的一种强有力的黏附分子，负责与邻近细胞的黏附[15]。现在普遍接受的是，在大多数癌症的肿瘤进展期间观察到E-钙黏蛋白表达的改变，这通常导致肿瘤细胞的侵袭性增加和癌细胞转移[8,16]。本研究结果显示，E-钙黏蛋白在结肠癌组织中表达降低(P<0.001)，并且E-钙黏蛋白表达与结肠癌有无淋巴结转移、临床分期以及分化程度有关，与无淋巴结转移患者相比，淋巴转移患者中E-钙黏蛋白表达更低；临床分期Ⅲ-Ⅳ期以及低分化患者中E-钙黏蛋白表达更低(P<0.001)。表明随着结肠癌的恶性程度进展加剧，E-钙黏蛋白表达降低。体外实验结果也证实这一结论，敲低SW480细胞中E-钙黏蛋白表达增加了SW480细胞的侵袭能力，表明E-钙黏蛋白降低会促进结肠癌的转移。

研究表明目前CD103的唯一已知配体是E-钙粘蛋白[17,18]。研究发现黑色素瘤中E-钙黏蛋白的缺失抑制CD103抗肿瘤活性[19]。然而，尚未研究E-钙黏蛋白在结肠癌中的表达对CD103+TIL抗肿瘤活性的影响。本研究结果显示，从结肠癌组织中分离的TIL在过表达CD103后对SW480细胞的杀伤活性显著增强，而这种杀伤效应在E-钙黏蛋白敲低后消失。这表明E-钙黏蛋白的缺失抑制CD103+TIL抗肿瘤活性，主要是由于E-钙黏蛋白表达降低，与肿瘤浸润淋巴细胞上的CD103结合减少，导致TIL与癌细胞接触减少，因此TIL的杀伤活性降低。即使此时增加CD103的表达，但是由于缺乏配体，也难以增加TIL的杀伤活性。CD103+TIL细胞需要与肿瘤细胞接触并黏附于肿瘤细胞上从而发挥细胞毒性功能。

综上所述，本研究结果表明CD103和E-钙黏蛋白在结肠癌的发展及侵袭转移中发挥重要作用。TIL细胞通过CD103对表达E-钙黏蛋白的肿瘤细胞进行免疫监视，未来的治疗策略可能是寻求扩增CD103免疫细胞亚群，以靶向表达E-钙黏蛋白的肿瘤细胞。