重症肌无力患者血浆外泌体microRNA表达谱的初步研究①

李梦夏 徐宏炎 韦敏光 包卓华 徐 肖 刘竞丽 李劲频

(广西医科大学第一附属医院神经内科，南宁 530021)

重症肌无力(myasthenia gravis，MG )是一种由乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)介导、细胞免疫依赖、补体参与的累及神经肌肉接头处传递功能障碍的获得性自身免疫性疾病[1,2]，其发病机制尚未完全阐明。微小核糖核酸(miRNA)是一类平均长度为22个核苷酸(nt)的小分子非编码RNA，主要在转录后对基因表达起调控作用，涉及细胞发育、增殖、分化、凋亡等主要的生物过程[3，4]。研究表明,miRNA可作为多种自身免疫疾病诊断的潜在生物标志物[5]。外泌体是直径范围30～100 nm、密度范围1.13～1.19 g/ml，由细胞释放到细胞外空间或生物液体中的小膜包裹的微小囊泡，存在于许多生物液体中，包括血液(血清、血浆)、尿液、唾液、母乳、羊水、腹水、脑脊液、胆汁和细胞上清液等，富含核酸和蛋白质，通过向远处的组织传递信息，介导细胞间的通讯，从而调节细胞的增殖、分化、死亡和免疫反应等[6-9]。外泌体保护miRNA免受血浆RNA酶的侵袭，在不同的储存条件下，均能保持较好的稳定性，因此，外泌体miRNA可作为疾病潜在的生物标志物[10-12]。目前尚未见MG血浆外泌体miRNA的相关报道，因此我们研究了MG患者血浆外泌体miRNA的差异表达谱，以寻找诊断MG的潜在生物标志物。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1一般资料 收集2017年3月～2017年8月在广西医科大学第一附属医院门诊及住院确诊的MG患者8例，MG组纳入标准：①随意肌无力，伴有典型的活动后症状加重、休息后减轻或晨轻暮重现象，并且肌疲劳试验阳性。②新斯的明试验阳性。③肌电图呈现低频重复神经电刺激波幅递减和(或)单纤维肌电图颤抖(Jitter)增宽。④血清抗AchR抗体滴度升高。具备上述诊断标准中的①，同时至少具备②～④中的一项，即明确诊断为重症肌无力。排除标准：排除妊娠期女性以及合并心、肺、肝、肾功能衰竭患者。设立年龄及性别匹配的健康体检者为对照组。重症肌无力组中OMG 4例[女∶男=4∶0，年龄(23.0±12.2)岁]，GMG 4例[女∶男=3∶1，年龄(38.5±13.5)岁]；对照组2例[女∶男=1∶1，年龄(30.0±7.1)岁]。用含EDTA的抗凝管收集患者及健康对照者全血5 ml，备用。各组间患者年龄、性别构成比较无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。本研究通过广西医科大学第一附属医院研究伦理委员会的批准。所有患者及对照者均签署知情同意书。

1.1.2主要试剂和仪器 外泌体试剂盒exoRNeasySerum/PlasmaMidiKit(德国 QIAGEN公司)，透射电子显微镜(日本日立集团H7650)，miRNA(v.18.0)基因芯片(广州市锐博生物科技有限公司)，Genesis软件。

1.2方法

1.2.1血浆外泌体的分离与鉴定 ①外泌体的提取：取患者或健康对照者全血5 ml，4℃条件下，3 000 r/min离心15 min取上清液，按照说明书利用外泌体试剂盒exoRNeasySerum/PlasmaMidiKit进行提取；②外泌体的鉴定：透射电镜法鉴定exosomes：将提取的exosomes做BCA 蛋白定量,用PBS( pH = 7.4 ) 将浓度稀释为0.5 mg/ml，吸取20 μl 滴到碳膜铜网上，置于红外灯下5 min至烘干，在碳膜铜网上滴1滴1%磷钨酸，置于红外灯下5 min 至烘干，H7650透射电镜下观察。

1.2.2不同类型MG患者血浆外泌体源性miRNA表达谱差异的比较分析 采用深度测序联合芯片技术(由广州锐博生物科技有限公司完成)，对不同类型(眼肌型、全身型)MG患者血浆外泌体源性miRNA的表达情况进行分析，并与健康对照组比较，统计外泌体源性miRNA在各组之间的相对表达量，筛选出在血浆中表达差异的外泌体源性miRNA，从而获得不同MG类型相关的血浆候选外泌体源性miRNA。

1.3统计学处理 芯片数据统计学分析应用Edge R软件，由广州锐博生物科技有限公司完成；芯片聚类分析应用Genesis软件。差异表达的标准设为：上调者其log2(Fold change)值>2，下调者其log2(Fold change)值<-2，以P<0.01为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1血浆外泌体分离和鉴定 利用透射电镜观察所提血浆外泌体形态，可以看出外泌体呈圆形或类圆形，双层脂质分子结构，大小分布不均匀，直径范围在 30～100 nm(图1)；流式细胞仪检测结果显示：CD63阳性率66.9%，CD81阳性率89.1%(图2)。上述结果与正常外泌体特点相符。

图2 流式细胞仪检测外泌体表面特异性标志CD63和CD81表达水平Fig.2 Exosome surface specific markers CD63 and CD81 expression levels detected by flow cytometryNote:A.Scatter plot；B，C.Unstained negative control；D.CD63 staining；E.CD81 staining.

2.2分析血浆外泌体源性miRNA的表达 采用Genesis分析软件对差异表达的miRNA进行聚类分析， 结果见图3A、B。OMG 组与正常对照组比较有显著差异表达的 miRNA 共4个 (表1) ， 其中1个下调，为hsa-miR-3667-5p，3个上调，上调最显著的为hsa-miR-3182；GMG组与正常对照组比较有显著差异表达的miRNA共48个(表2)，其中下调16个，下调最显著的为hsa-miR-516a-5p，32个上调，上调最显著的为hsa-miR-1273f。 将OMG、GMG组中的miRNA表达谱进行对比，发现OMG组中差异表达的4个miRNA，在GMG组中均有一致的差异表达。见表1、表2。

表1 OMG组与正常对照组显著差异表达的血浆外泌体miRNATab.1 Plasma exosomes miRNAs significantly different in OMG group and normal control group

表2 GMG组与正常对照组显著差异表达的血浆外泌体miRNATab.2 Plasma exosomes miRNAs significantly different in GMG group and normal control group

图3 聚类分析热图Fig.3 Cluster analysis heat mapNote:A.Cluster analysis heat map of OMG group and normal control group；B.Cluster analysis heat map of GMG group and normal control group.In the figure,red indicates that miRNA is up-regulated,and green indicates that miRNA is down-regulated;the small picture above is a chroma key diagram,and different color gradients represent different expression levels.

3 讨论

2012年Lin等[13]首次报道了重症肌无力与miRNA的相关研究，他们分析了MG患者外周血单个核细胞的miRNA表达谱，发现21个过表达的miRNA，其中let-7家族水平显著降低，并发现其抑制了Jurkat细胞中白介素- 10的表达，从而影响MG发病和进展。重症肌无力与胸腺异常关系密切，本课题组前期研究了MG患者异常胸腺(胸腺瘤、胸腺增生)与正常胸腺miRNA表达谱的差异，也发现了MG患者胸腺组织中有多个异常表达的miRNA[14]，我们还通过生物信息学方法预测到其中miR-125a-5p的靶基因为Foxp3，并证明了Foxp3基因在Jurkat细胞中的表达受miR-125a-5p调控[15]。此外，我们在伴胸腺增生的MG患者miRNA的研究中，发现miR-548k负调控Jurkat细胞中CXCL13 mRNA的表达[16]。这些研究发现不同的miRNA可能通过调控不同的与免疫相关的靶基因影响MG的发病和进展。

而在一项AchR-Ab阳性MG的研究中，miR-150-5p和miR-21-5p在血清中表达增高，但在使用免疫抑制剂后表达降低[17]。 Zhang等[18]发现使用miR-146a抑制剂沉默miR-146a可有效改善实验性自身免疫性重症肌无力小鼠的临床肌无力症状，并且在B细胞中敲除miR-146a后观察到多种缺陷，包括抗R97-116抗体产生减少，浆细胞、记忆B细胞和B-1细胞数量减少，B细胞活化减弱；因此认为沉默miR-146a可影响B细胞的功能，从而在重症肌无力的治疗中发挥作用。在最新的一项前瞻性研究中，发现miR-30e-5p是从OMG转化为GMG的风险预测因子之一[19]。这些研究表明，重症肌无力患者中存在异常表达的miRNA，可能通过调控靶基因的表达而影响疾病的发生发展。

外泌体是miRNA的富集体，有报道称外泌体携带功能性mRNA和能够在细胞间转移的miRNA，外周血中的外泌体可能反映了外泌体起源器官的状态，因此是疾病潜在的生物标志物以及对疾病的治疗或进展的预后指标[12，20]。Zhang等[21]发现下丘脑神经干/祖细胞分泌的外泌体miRNA介导了部分抗衰老作用。在不同疾病的研究中，都发现了异常表达的外泌体miRNA，如急性髓性白血病、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子痫前期等，这些异常表达的miRNA有望成为辅助疾病诊断和治疗的工具[22-26]。

本研究中，我们发现在OMG组中显著差异表达的miRNA有4个，分别为hsa-miR-3667-5p、hsa-miR-3182、hsa-miR-6843-3p、hsa-miR-1273f；在GMG组中显著差异表达的miRNA有48个；并且OMG组中显著差异表达的4个miRNA，在GMG组中均发现了一致的差异表达，说明OMG与GMG可能存在共同的发病机制，也说明这4个差异表达的miRNA与MG的发生有关。其中hsa-miR-3667-5p、hsa-miR-3182在其他疾病的研究中也有相关的报道，例如，Kaur等[27]研究发现了hsa-miR-3667-5p在复杂间日疟原虫病中具有显著的差异表达；在一项研究肾脏疾病miRNA的研究中，发现hsa-miR-3182在IgA肾病患者中显著下调，此外，hsa-miR-3182在肺腺癌、结直肠癌、多形性胶质母细胞瘤中均发现有差异表达[28-30]；提示当miRNA异常表达时，它们可能导致涉及免疫系统的病理状态，参与疾病的发生发展，如癌症和自身免疫性疾病等。而显著差异表达的hsa-miR-6843-3p、hsa-miR-1273f未见相关报道，我们推测其可能是MG中差异表达的miRNA，通过特定的机制参与MG的发病和进展。我们的研究也是首次对MG患者血浆外泌体miRNA的表达谱进行检测，下一步将通过体内外模型对这些差异表达的miRNA在MG诊断中的作用进行验证。

综上所述，我们在研究中发现了MG患者血浆外泌体中存在多个差异表达的miRNA，提示其在MG疾病的发生发展中可能存在一定的作用，而显著差异表达的miRNA，特别是hsa-miR-6843-3p和hsa-miR-1273f，可进一步研究其作为诊断MG的潜在生物标志物的可能性。