免疫细胞耗竭调控机制研究进展①

李 蕾 张 彩

(山东大学药学院免疫药物学研究所，济南 250012)

正常情况下，初始T细胞接受抗原刺激后快速增殖、分化成效应性T细胞，发挥免疫功能。病原体清除之后，大部分效应T细胞经历凋亡，只有小部分(5%～10%)存活下来进而分化成记忆性T细胞，在机体再次接受相同病原体入侵时快速、高效产生免疫应答，发挥保护作用[1-3]。而在慢性病毒感染或肿瘤微环境中，由于抗原的持续刺激，T细胞获得记忆表型的进程受到阻滞，并逐渐失去效应功能，呈现无应答的状态，称为免疫耗竭[3]。1998年，免疫耗竭的概念在小鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)慢性感染中被首次提出[4,5]。随后，这一现象在其他疾病类型中也逐渐被发现，例如HIV、HBV、HCV以及肿瘤[6-9]。与效应T细胞相比，耗竭的T细胞表现出功能损伤的状态，通常表现为效应分子IFN-γ、TNF-α、IL-2等分泌水平下降，细胞表面多种抑制性受体持续性高表达，关键转录调控过程的改变以及能量代谢变化[3,10]。CD8+T细胞免疫耗竭是目前研究最为广泛和深入的，除CD8+T细胞之外，CD4+T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞也会发生免疫耗竭[11-13]。免疫细胞耗竭现象在肿瘤及慢性感染中普遍存在，不利于机体免疫系统杀伤肿瘤细胞及清除病毒感染，并且现已发现调控免疫细胞耗竭的途径多样且复杂。本文就目前对免疫细胞耗竭研究所取得的进展做一综述，进而为逆转免疫细胞耗竭、慢性感染及肿瘤研究和治疗提供靶点。

1 耗竭免疫细胞的特点

耗竭的免疫细胞表现出与效应性细胞及记忆性细胞不同的特点。

1.1效应功能障碍 效应细胞功能障碍是耗竭的免疫细胞最重要的表现。有研究发现，在细胞耗竭的不同阶段，其功能障碍的表现也不尽相同。在耗竭的初期，T细胞还具备分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子的能力，但此时，其细胞毒作用较弱；而在耗竭的晚期，T细胞逐渐失去分泌细胞因子的能力，但细胞毒作用与前期相比有一定程度的升高[14,15]。

1.2细胞表面抑制性受体持续性高表达 尽管在T细胞活化的过程中，抑制性受体如PD-1表达有短暂的升高，但在耗竭的T细胞表面则表现为多种抑制性受体的持续性高表达以及几种抑制性受体共表达[3]。

1.3IL-7Rα及IL-2/15Rβ信号通路受损 急性感染中，随着抗原的清除，效应性T细胞分化为记忆性T细胞，并逐渐上调IL-7Rα和IL-2/15Rβ表达，在IL-7和IL-15等细胞因子的作用下，记忆性T细胞可以不依赖于抗原而长期在体内存活[16,17]。而在慢性感染过程中，由于耗竭的T细胞上IL-7Rα和IL-2/15Rβ信号通路受损，IL-7和IL-15的作用受到抑制，反而抗原肽是维持耗竭T细胞存活所必需的[18]。

1.4代谢改变 正常情况下，免疫细胞受到抗原刺激后，代谢方式从氧化磷酸化转变为有氧糖酵解，为细胞增殖及分泌效应分子快速提供能量，而耗竭的T细胞中有氧糖酵解和氧化磷酸化等代谢途径障碍，代谢通路中关键分子PGC1α及myc等表达受到抑制[19,20]。

1.5转录进程不同 研究发现，与效应性及记忆性CD8+T细胞相比，耗竭的CD8+T细胞具有不同的转录程序，尽管和效应性及记忆性CD8+T细胞存在相同的转录因子，但在表达量及关键转录因子间的作用网络上有所不同[21]。

1.6表观遗传修饰存在差异 表观遗传学研究显示，耗竭T细胞是表观遗传特征不同于效应性及记忆性T细胞的独特细胞谱系，CD8+T细胞发生耗竭的过程伴随着基因启动子区域和转录因子结合区域的广泛重建[22]。

2 调控免疫细胞发生耗竭的机制

2.1持续抗原刺激 如前所述，记忆性T细胞在抗原清除后可以在体内长期存活，而耗竭的T细胞则需依赖于抗原肽的持续刺激才能维持存活。而且，抗原的持续刺激也是免疫细胞发生耗竭的必要条件[3]。过继转输实验证明，慢性感染早期阶段的CD8+T细胞转输至正常小鼠后可以发生耗竭逆转并且可以向记忆性CD8+T细胞分化，而如果长期暴露于抗原刺激则耗竭状态不可逆转，反之，将急性感染早期病毒特异性CD8+T细胞转输至慢性感染小鼠体内则不能避免其耗竭的发生[23]。

2.2抑制性受体 免疫细胞表面表达多种共刺激和共抑制性受体，与相应的配体结合之后为细胞提供刺激信号，帮助细胞活化或者提供抑制信号削弱细胞的功能。耗竭的免疫细胞持续高表达多种抑制性受体，目前已有大量研究报道了抑制性受体在慢性病毒感染和肿瘤微环境中的作用，比如PD-1、CTLA-4、Tim-3、2B4、CD160、LAG-3、BTLA及TIGIT等[24,25]。研究发现，免疫细胞耗竭程度和细胞上抑制性受体表达情况有关，与单一抑制性受体高表达相比，两种甚至多种抑制性受体共表达更能代表免疫细胞耗竭的状态。比如在小鼠LCMV慢性感染中，PD-1+Tim-3+双阳性病毒特异性CD8+T细胞功能耗竭程度要远远高于单阳性的CD8+T细胞[26]。黑色素瘤患者体内肿瘤抗原特异性BTLA+PD-1+Tim-3+CD8+T细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-2的能力明显低于单阳性或双阳性的CD8+T细胞[27]。除了上述免疫检查点抑制性受体之外，新近的研究还发现多种耗竭相关的抑制性分子，例如，在肿瘤环境中高表达的细胞表面分子活化蛋白C受体(PROCR)和平足蛋白(PDPN)[28]，这些分子可能作为新的免疫检查点来调节免疫细胞的效应功能。

2.3抑制性细胞因子 在病毒慢性感染和肿瘤发生时，机体免疫细胞处于一种免疫抑制的微环境中，多种因素向免疫细胞传递抑制性信号。抑炎因子IL-10在促进T细胞耗竭及维持病毒长期存活中发挥重要的作用，尤其是单核巨噬细胞和CD4+T细胞来源的IL-10是发挥免疫抑制作用的关键角色[29,30]。TGF-β是另一重要的免疫负调分子，TGF-β不仅可以抑制CD8+T细胞分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子，还可以通过上调促凋亡蛋白Bim的表达来促进病毒特异性CD8+T细胞的凋亡[31]。

2.4抑制性细胞 在慢性病毒感染或者肿瘤存在时，机体内的一些免疫负调细胞如调节性T细胞(Treg)、骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)及肿瘤相关巨噬细胞(TAM)比例升高，这些细胞可以通过多种途径参与免疫抑制。Treg细胞不仅可以通过分泌TGF-β发挥免疫抑制作用，还可以通过控制效应T细胞中IL-2的转录来抑制效应T细胞的增殖，并且通过抑制性受体CTLA-4与效应T细胞上CD80/CD86结合而直接抑制T细胞活化，或者和抗原递呈细胞(APC)上CD80/CD86分子结合，引起吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的活化进而影响必需氨基酸——色氨酸的代谢，进而抑制T细胞的活化[32,33]。同样，MDSC也是TGF-β的来源之一，并且还可以通过精氨酸损耗发挥抑制功能。精氨酸不足可导致T细胞、NK细胞增殖受阻和细胞周期阻滞，抑制NK细胞IFN-γ分泌，影响效应细胞的功能。此外，MDSC还能升高体内活性氧(ROS)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的水平进而促进NO产生增多[34]。研究发现，NO可以通过Jak/Stat信号通路、诱导T细胞凋亡以及降低MHC表达水平等多种途径来发挥免疫抑制作用[35-37]。TAM细胞主要由M2型巨噬细胞组成，与正常巨噬细胞相比抗原提呈能力较弱，并且可以分泌IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子来削弱T细胞对肿瘤细胞的杀伤功能[38]。

2.5转录因子 转录因子在免疫细胞的分化过程中发挥重要作用，在慢性感染的小鼠和人体内存在两种不同状态的病毒特异性CD8+T细胞，转录因子T-bet和Eomes的表达高低在维持和促进这两种细胞状态的转化过程中至关重要。持续的抗原刺激使得T-bethiPD-1mid细胞群逐渐丧失T-bet表达进而向EomeshiPD-1hi细胞群转化，后者对PD-1抗体阻断疗法反应不明显[3,39]。转录因子NFAT在T细胞活化过程中起着关键的调节作用[40]，细胞因子IL-2、IL-3、IL-4以及集落刺激因子(GM-CSF)的表达依赖于NFAT和Fos-Jun(AP-1)结合所形成的复合体[41]，而NFAT不与AP-1结合则减弱TCR信号传导并且诱导抑制性受体升高，促进T细胞的失能以及耗竭[42]。Blimp-1被证明在小鼠慢性LCMV感染病毒特异性CD8+T细胞中表达升高，并且促进多种抑制性受体表达和共表达[43]。在人急性髓系白血病中，Blimp-1直接结合抑制性受体PD-1和TIGIT的启动子区域，促进两者表达，抑制T细胞的效应功能[44]。除了Blimp-1可以单独调控多种抑制性受体表达之外，在黑色素瘤和结肠癌小鼠模型中，转录因子c-MAF可以与Blimp-1协同作用，在T细胞中同时缺失这两种转录因子能够明显提高T细胞的效应功能，有效抑制肿瘤的生长[28]。有文献报道，在黑色素瘤中，CD8+T细胞内Maf的过表达可抑制其抗肿瘤功能，使其向耗竭表型极化[45]。在肿瘤浸润的效应T细胞中，转录因子Foxp1表达明显上调，高表达的Foxp1通过与Smad家族成员相互作用来介导肿瘤微环境中TGF-β的免疫抑制作用，或者直接介导TGF-β诱导的c-Jun转录抑制作用，使T细胞活性受损，最终导致CD8+T细胞增殖、分泌IFN-γ和Granzyme B的能力下降[46]。LCMV慢性感染中，病毒特异性CD8+T细胞转录因子IRF4、BATF高表达，抑制或缺失IRF4表达后，抑制性受体PD-1、Tim-3、LAG-3、2B4、TIGIT和CTLA-4等表达均随之降低，减少或缺失BATF后存在同样的现象，而且，IRF4的高表达还可抑制效应性CD8+T细胞向记忆性CD8+T的分化[47]。

反过来，抑制性受体也可以上调某些转录因子的表达，比如，HIV特异性CD8+T细胞上PD-1的表达升高可以上调转录因子BATF的表达，进而损伤T细胞增殖和分泌细胞因子的能力[48]。在慢性病毒感染过程中，AKT-mTOR信号通路的活化受到抑制，导致转录因子FoxO1的活性升高，FoxO1可以诱导抑制性受体PD-1的表达，进而降低抗原特异性T细胞对抗原的敏感性[49]，同时FoxO1可以抑制T-bet表达，促进抗原特异性T细胞向记忆性表型分化，维持细胞存活[50]。

2.6表观遗传修饰 表观遗传修饰是指在DNA序列不改变的情况下，基因功能的可遗传变化。修饰途径主要包括：DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA介导的转录及转录后调控[51]。

在慢性LCMV感染中，病毒特异性CD8+T细胞中二乙酰化组蛋白H3表达下调，无法产生效应分子IFN-γ和IL-2，其功能呈现耗竭状态[52]。在初始T细胞接受抗原刺激分化为效应T细胞的过程中，Pdcd1基因启动子区域去甲基化，随着病毒清除，效应T细胞分化为记忆细胞，Pdcd1基因座发生再甲基化。相反，在慢性LCMV感染中Pdcd1基因则完全去甲基化，病毒特异性CD8+T细胞持续高表达PD-1[51,53]。DNA甲基转移酶抑制剂与组蛋白去乙酰化酶抑制剂的联合使用可逆转非小细胞肺癌模型鼠中耗竭的T细胞向效应和记忆表型转化，从而促进抗肿瘤免疫[54]。

非编码RNA如microRNA和lncRNA在调控T细胞功能的过程中也扮演着重要的角色。miR-155通过抑制Ⅰ型干扰素作用促进抗病毒CD8+T细胞的增殖[55]，另一方面miR-155又可促进CD8+T细胞上多种抑制性受体表达和共表达，驱动CD8+T细胞向耗竭表型转化[14]。miR-31通过靶向Ppp6c促进Ⅰ型干扰素信号，上调耗竭相关基因，抑制效应分子表达来促进CD8+T细胞耗竭[56,57]。在HCC患者CD8+T细胞中，Lnc-tim3表达上调，其和Tim-3特异性结合，促进Bat3核转位，促进CD8+T细胞耗竭[58]。同样，Lnc-EGFR在HCC患者中也存在高表达的现象，高表达的Lnc-EGFR促进Treg细胞生成并且抑制CD8+T细胞效应功能，加剧肿瘤的发生发展[59]。

2.7细胞代谢 除了抑制性受体和其配体结合、抑炎因子(IL-10、TGF-β等)、免疫抑制细胞(Tregs、MDSC、TAM等)抑制免疫细胞的效应功能之外，肿瘤微环境还能抑制免疫细胞的代谢活动。肿瘤细胞不仅可以竞争性剥夺免疫细胞代谢所需要的营养物质，而且其产生的有害代谢产物堆积也可以抑制免疫细胞功能[20,60]。活化的NK细胞需要剧烈的代谢活动来支持效应功能，抑制细胞代谢可削弱NK细胞产生IFN-γ以及杀伤能力[61]。在肿瘤发生发展的过程中，NK细胞逐渐丧失抗肿瘤功能呈现耗竭状态，研究发现，在小鼠肺癌模型中NK细胞中FBP1的异常表达通过损伤NK细胞的糖代谢活动来抑制NK细胞的抗肿瘤功能而呈现耗竭的状态[62]。和NK细胞一样，T细胞的功能耗竭与细胞代谢活动同样密不可分。慢性乙肝患者体内病毒特异性CD8+T细胞存在线粒体代谢失调的现象，具体表现为线粒体去极化以及大量ROS的产生，这就使得HBV特异性CD8+T细胞无法有效地进行氧化磷酸化来提供能量，而使用靶向线粒体的抗氧化剂可以显著改善线粒体和耗竭的病毒特异性CD8+T细胞功能，说明线粒体代谢活动在耗竭的CD8+T细胞中的重要作用[63,64]。

2.8其他 除了上述调控因素以外，近年来的研究工作还不断揭示出在免疫耗竭过程中发挥作用的新机制。例如，在黑色素瘤中，P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)可以上调多种抑制性受体，如PD-1、Tim-3及LAG-3表达，从而作为免疫检查点调控分子促进效应T细胞的功能耗竭[65,66]。SLAM家族成员CD84不仅可以上调肿瘤细胞及其微环境中基质细胞上PD-L1，还可以促进CD8+T细胞上PD-1及其他抑制性受体表达，极大程度上削弱了CD8+T细胞的效应功能[67]。

3 结语与展望

在慢性感染或肿瘤存在的情况下，抗原特异性T细胞发生耗竭的调控机制是多样且复杂的。多种转录因子可以调控抑制性受体表达和共表达，而且转录因子之间可以相互调控，比如，IRF4启动子区域存在NFAT家族的结合位点，NFAT缺失之后，IRF4的表达受到抑制。除此之外，耗竭的T细胞中IRF4抑制了合成代谢和线粒体功能，影响了能量代谢为免疫细胞发挥效应功能提供所需的能量供应[47]。免疫耗竭机制的揭示可为慢性感染和肿瘤治疗提供众多潜在的研究靶点和策略。目前免疫检查点阻断治疗已在病毒感染和肿瘤治疗中取得了有目共睹的效果。阻断PD-1信号通路可以有效恢复LCMV慢性感染模型中耗竭的T细胞功能，降低病毒载量，因此，以抑制性受体为靶点成为恢复耗竭T细胞效应功能的有效策略[68]。的确，临床前研究表明，免疫检查点阻断可以明显增强免疫细胞的功能，有效控制肿瘤生长、降低病毒载量。PD-1单抗Pembrolizumab和Nivolumab通过FDA批准，标志着免疫检查点阻断在肿瘤临床治疗上的重大进展[69]。在慢性感染和肿瘤模型中，干扰调控抑制性受体的关键转录因子(例如Blimp-1及IRF4等)表达同样观察到了明显的效果[44,47]。随着细胞代谢在免疫耗竭领域成为研究热点，靶向耗竭免疫细胞代谢异常成为一种潜在的治疗靶点。PGC-1α为转录共激活因子，在线粒体生物合成、葡萄糖代谢等方面具有重要作用，在LCMV慢性感染中，过表达PGC-1α可以增强耗竭T细胞的功能，增强免疫检查点阻断的治疗效果[19]。在HBV慢性感染中利用靶向线粒体抗氧化剂，调控ROS生成，可以显著改善线粒体和CD8+T细胞抗病毒的功能[64]。这些研究逐渐确定了在肿瘤及病毒慢性感染中免疫细胞耗竭的特征及发生发展的机制，并在一些模型中取得了比较显著的效果，为临床治疗提供了更多、更新颖的靶点，给肿瘤和慢性感染患者痊愈带来了新的希望。