肿瘤微环境刚性的病机探讨❋

高卓维，韩钦芮，符秀琼，姚学清，陈腾祥，孙学刚,△

(1.南方医科大学顺德医院，广东 佛山 528300；2.南方医科大学中医药学院，广州 510515；3.广东省人民医院胃肠外科，广州 510080；4.贵阳医科大学科技处，贵阳 550025)

机体某个部位的硬块，临床医生会高度怀疑其是否为肿瘤，这提示相比于原有的正常组织，实体肿瘤的硬度增加。肿瘤微环境的重构是“积聚”硬度逐渐增强的主要机制。我们此前提出，在正气亏虚基础上，痰凝、血瘀参与肿瘤微环境的重构，导致癌毒结聚[1-2]。《灵枢·百病始生》：“肠胃之络伤，则血溢于肠外，肠外有寒，汁沫与血相搏，则并合凝聚不得散，而积成矣”，提示痰瘀可能参与汁血相搏而凝聚成积的过程。因此，从微环境刚性的角度解析“癥积”病机，有助于建立癥积硬度与免疫调控之间的联系，亦提供软坚散结调控肿瘤免疫的新思路。

1 ECM重构促进肿瘤“刚性”微环境形成

病变部肿块坚硬如石，高低不平，状似岩突，故名岩。岩与癌同[3]，这种肿瘤的硬度改变与临床触诊的常识相符。夫众病积聚皆起于虚，虚久血瘀痰凝而为癥瘕。肿瘤微环境中细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)的动态重塑是肿瘤刚性调控的关键机制。一方面是细胞外基质蛋白的表达水平与相对组成发生改变，另一方面ECM空间拓扑结构与刚性等物理学性质的改变，使肿瘤组织的硬度显著高于正常组织[4]。

ECM是围绕着细胞的三维结构，主要有两类：一类是主要由IV型胶原蛋白、层黏连蛋白、巢蛋白和蛋白聚糖组成的直接与上皮细胞或内皮细胞相互作用的基底膜(basement membrane)；另一类主要由I型和III型胶原蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、腱糖蛋白组成的间质基质(interstitial matrix)，它构成细胞外基质的主体。结直肠癌(colorectal cancer,CRC)不同分期的ECM与癌细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)表达呈负相关，而与整合素αvβ6的表达正相关，CRC分期越高ECM促进癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)的能力越强[5]。间质起源的结缔组织生成(desmoplasia)与CRC的预后不良和转移性复发相关，提示CRC发生发展过程伴随结缔组织生成与纤维化。该过程与《灵枢·百病始生》“温气不行，凝气蕴裹而不散，津液涩渗，着而不去，而积皆成矣”的描述相似。

朱丹溪[6]云：“凡人身上、中、下有块者，多是痰。”而ECM的过量沉积及其组织形式的异常形成是机体损伤修复而“成块”的关键步骤，因此ECM重构并在肿瘤微环境沉积形成“有形之痰”。丹溪学派医家认为，痰为津液脾湿所生。我们此前提出脾虚(甚则及肾)是肿瘤微环境的核心病机，脾胃虚损、中气匮乏、失其健运之常，遂聚湿而生痰[2,7-8]。《肘后备急方》[9]言：“凡癥坚之起，多以渐生，如有卒觉便牢大，自难治也”，表明自癥积之初，其性渐坚，痰凝日久，终致《灵枢·百病始生》之谓：“虚邪之中人也……稽留而不去，息而成积”，终牢大难治，如《外证医案汇编》 云：“正气虚则为岩。[10]”

2 CAFs是微环境“硬化”的关键细胞组分

肿瘤微环境ECM重构的核心是活化的成纤维细胞，即肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)。与静息成纤维细胞相比，活化的成纤维细胞分泌更高水平的细胞外基质蛋白增殖更快、活性增强。肿瘤中的成纤维细胞是持续激活的，因此肿瘤也被称为是“无法修复的损伤”[11]。CAFs不断分泌促进迁移的细胞外基质成分，如胶原蛋白、腱糖蛋白等，结合细胞因子和生长因子等并调控细胞对上述因子的响应[12]；CAFs还可以上调丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶的表达，如赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)促进ECM中的胶原与弹性蛋白聚合并稳定ECM；尿激酶型纤溶原激活剂(urokinade-type plasminogen activator,uPA)是纤溶酶酶原激活成纤溶酶必需的；基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase 1,MMP-1)和MMP-3可以降解和重塑ECM，ECM的重塑和胶原蛋白的交联引起ECM刚性增强[13]。《丹溪心法附余》曰：“凡人头面颈颊身中有结核，不痛不红，不作脓者，皆痰注也”[14]，因此CAFs是肿瘤生“痰”之源，所生之痰注逐渐蓄积、随气升降、流动不测、黏滞胶着、秽浊腐败、性趋结聚而致病。

基底膜与间质基质共同决定组织的机械强度[4]。CAFs能够产生不同的胶原和纤维连接蛋白，是间质基质中合成和沉积ECM所必不可少的；CAFs分泌层黏连蛋白和IV型胶原，为产生基底膜所必需，因此CAFs是肿瘤刚性微环境形成的决定性细胞组分。

肿瘤微环境中的CAF活化，导致ECM沉积、炎症细胞浸润和血管生成[15]。《杂病广要》[16]曰：“血随气结，痰亦缘火相附而升，遂合并而成形质。”《丹溪心法·积聚痞块》[6]云：“气不能作块成聚，块乃有形之物也，痰与食积、死血而成也。”朱丹溪[6]提出“痰挟瘀血，遂成窠囊”，其理论基础在于痰源于津，瘀本于血，津血互根同源，则痰瘀亦可相互转化、相兼为病。因此，肿瘤微环境中ECM重塑和血管生成导致痰瘀交结、机械强度渐增，遂作块成聚，积聚乃生。

3 CAFs募集MDSCs和TAMs促进免疫抑制和ECM重构

活化CAFs上调chemokine (C-C motif) ligand如CCL2、CCL5和CCL7，并分泌多种生长因子如PDGFα/β、VEGF、SDF-1、HGF、MMPs和 IL-6等，与髓样细胞的募集呈正相关，而与T细胞数量呈负相关。在小鼠肝肿瘤模型，CAFs活化STAT3-CCL2信号通路，通过募集髓源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)促进免疫抑制[17]，而CAFs参与形成的CRC免疫抑制微环境与不良预后相关。CAFs募集髓单核细胞(myelomonocytic cells)、MDSCs和TAMs在肿瘤微环境聚集，释放TGF-β1、IL-10等免疫抑制因子，限制T细胞在肿瘤细胞近旁(vicinity)的累积，表明积聚刚性的增强进程，同时是以“本虚”免疫抑制微环境逐步形成并加重的过程。

CCLs招募髓样细胞和巨噬细胞向肿瘤微环境迁移和聚集，微环境中的MDSCs和TAMs释放大量强血管生成因子，如VEGF-A、VEGF-C、TNF-α、胎盘生长因子、趋化因子CXCL12、CXCL8和bFGF。TAMs还表达一系列蛋白酶，包括uPA、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-12和弹性蛋白酶等。uPA和MMP能够重构和降解ECM，降解的ECM引起生长因子的动员并促使血管细胞迁移建立新微环境[18]。因此，CAFs募集免疫细胞在微环境的累积，一方面促进微环境的ECM重构，另一方面则诱导免疫抑制微环境，形成免疫赦免样区域，是肿瘤生长的沃土。因此，抑制CAFs活化能降低I型胶原蛋白的表达，抑制具有多种抗药性肿瘤的生长和转移[19-20]。

肿瘤刚性微环境一方面提升肿瘤内部的组织液压，降低药物在肿瘤中的富集利用；另一方面能够促使TAM从具有免疫清除功能的M1型向免疫抑制的M2型转化，却限制了细胞毒性T细胞在微环境的聚集，使肿瘤微环境维持在免疫抑制的状态，如《局方发挥》云：“自气成积，自积成痰”[21]，遇瘀血而搏结，导致窠囊之属，因实致虚限制了肿瘤免疫治疗的效果。

4 软坚散结调节ECM重构改善刚性微环境

《素问·至真要大论篇》曰：“坚者削之”“结者散之”。汉·张仲景即用鳖甲煎丸治疗癥瘕，晋·葛洪善用海藻治疗瘿瘤。清·陈士铎《石室秘录》破解散、神效开结散等，均以软坚散结为治。《杂病源流犀烛》提出：“积聚、癥瘕、痃癖，因寒而痰与血食凝结病也。[22]”朱丹溪[6]云：“凡积病不可用下药，徒损真气，病亦不去，当用消积药，使之融化，则根除矣。”主张咸以软之，坚以削之，行气开痰。针对肿瘤，选用咸寒之品软坚散结以消痰积，旨在缓其坚之性，化其坚之形。

来源于骨髓、淋巴结或脾脏的免疫细胞向肿瘤细胞的募集，参与肿瘤微环境由软向硬的转变，也必然涉及机械力的信号改变，因此肿瘤微环境不仅仅是一个化学概念，ECM几何结构、空间拓扑结构及硬度等物理学特性可以作为机械信号调控肿瘤的生长、侵袭和转移[23-24]。软坚散结药中的硫酸多糖与硫酸糖肽等成分具有软化肿瘤微环境的作用[25]。基于此，我们检测了扶正化瘀散结方对小鼠原位CRC移植瘤硬度的作用，发现扶正化瘀散结显著抑制肿瘤的生长并降低其硬度，软坚散结药可能不能有效杀死肿瘤细胞，但可能通过调节机械力信号与ECM重构改善微环境的硬度，使解毒抗癌药直达病所而抑制肿瘤进展。

5 结语

CAFs的持续活化诱导细胞外基质重塑，微环境刚性增强；ECM的重构诱导整合素的聚集并激活下游信号FAK信号通路，又反过来促进CAFs活化状态的维持，CAFs与ECM交互调控共同形成肿瘤刚性微环境[26]。“痰之为物，随气升降，无处不到”[6]，肿瘤刚性微环境既是肿瘤生长的窠囊，又是发生转移的根源。因此，应用扶正化瘀散结法通过调整微环境CAFs的活化与ECM重构，改善微环境的刚性，可能是防治肿瘤的侵袭与转移的有效策略之一。