细胞毒T淋巴细胞抗原4基因多态性与肝癌易感性的相关性

赵斌 郭联斌 段武琼

肝细胞癌的致病因素包括环境、病毒感染、宿主肿瘤易感性等多种因素，而免疫力是影响宿主肿瘤易感性的重要因素。CD28分子与抗原递呈细胞表面的B7家族分子(CD80与CD86)结合产生的共刺激信号对于活化原始T淋巴细胞起到关键作用，也是机体抗肿瘤免疫的重要环节[1]。近年研究发现[2]，T细胞活化会受到T细胞表面激活分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxie T lylnphoeyte assoeiated antigen-4，CTLA-4)的影响。基础实验发现[3]，CTLA-4可与抗原递呈细胞表面的B7家族分子相结合从而协同抑制T细胞增生、活化，负性调节T细胞，使IL-2的产生与T淋巴细胞活化受到抑制。而CTLA-4与B7家族分子的结合力远高于CD28，是CD28结合B7分子的竞争性拮抗剂。现有证据表明[4]，CTLA-4基因多态性具有重要生物学意义，对宫颈癌易感性[5]、变应性鼻炎[6]遗传易感性等具有较大关联，但目前有关CTLA-4与肝癌易感性的研究仍鲜有报道。本研究对比肝癌患者与健康体检者的CTLA-4外显子49位点的基因型分布，探讨CTLA-4与肝癌易感性的相关性，现报道如下。

资料与方法

一、临床资料

本院2016年1月—2018年12月共收治70例肝癌患者，均经组织活检、CT或MRI查结合实验室检测确诊为肝癌，其中男40例、女30例；年龄39～62岁，平均(52.42±7.67)岁。另选取同期于本院进行健康体检的个体70例作为对照，男44例、女26例；年龄34～60岁，平均(50.81±8.20)岁。两组均排除酒精性/药物性肝病、自身免疫性肝损害、伴人类免疫缺陷病毒感染者。

二、方法

所有患者均进行CTLA-4多态性检测：①提取外周血DNA：采用DNA提取试剂盒(购自北京科恩堡生物科技有限公司)提取外周血白细胞DNA，置于-20℃下保存。②聚合酶链(PCR)反应：引物序列49A/G，正向：5′-AATTGGGATTTA-GGAGGACC-3′，反向：′-AATACAGAGCCAGCCAAGCC-3′。扩增反应体系10 μL，反应条件：95℃下变性5 min，35个循环；95℃下变性30 s，在60℃、58℃、60℃下退火30 s。72℃延伸10 min。扩增片段为641和486 bp。③CTLA-4的49A/G位点多态性检测：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态法，使用限制性内切酶BbvI对扩增产物进行酶切，水浴24 h，取4 μL酶切产物，上样于2%琼脂糖，电泳分离(120 V、25 min)。对PCR产物进行测序。

三、观察指标

比较2组的基因型分布(AA、AG、GG)及等位基因A、G频率，采用Spearman相关性分析CTLA-4基因多态性与肝癌易感性的相关性。

四、统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计处理，计数资料的比较采取χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、基因型分布

两组AA、AG、GG基因型的分布有统计学意义(P<0.01，表1)。

表1 两组基因型分布的比较n(%)

二、等位基因频率

肝癌组G等位基因频率为71.43%(50/70)，显著高于对照组51.43%(36/70)(χ2=5.909，P=0.015，P<0.05)。

三、相关性分析

Spearman相关性分析证实，CTLA-4基因多态性与肝癌易感性存在明显相关性(r=0.701，P=0.012，P<0.05)，具体表现为携带G等位基因会增加肝癌患病风险，OR=4.101(2.227～10.031)。

讨 论

CTLA-4基因的49位点A/G多态性已被证实与多种免疫性疾病有关，已有证据表明[7]，CTLA-4基因的49位点多态性会影响乙肝易感性，GG基因型携带者感染HBV风险明显高于其他基因型携带者。鉴于以上，有专家推测[8]，CTLA-4基因的49位点的多态性也会影响肝癌易感性。

本研究将肝癌患者与健康对照者的CTLA-4基因的49位点基因型分布进行对比，发现2组的基因型分布存在显著差异，具体表现为肝癌组以GG基因型最多见，而正常组则以AG基因型最多见，肝癌组G等位基因频率为71.43%，高于对照组51.43%。相关性分析结果证实，CTLA-4基因多态性与肝癌易感性明显相关，携带G等位基因患肝癌风险是携带A基因的4.101倍。目前研究显示[9]，CTLA-4基因上存在6个多态性位点，其中外显子1第17密码子的49位点的单核苷酸多态性的生物学作用最广泛。CTLA-4外显子1区编码49位点野生型为A等位基因，易突变为G等位基因，使该区编码的苏氨酸转变为丙氨酸，引起蛋白质变性，使T细胞对CTLA-4分子相关蛋白的合成和表达减弱，造成T淋巴细胞表面的成熟CTLA-4分子减少，产生以下影响：①使T细胞活化周期停留在G0或G1期，不向S期进展，最终导致自身免疫性疾病或肿瘤的发生。②介导不依赖Fas途径的T细胞凋亡，抑制T细胞分化与增殖，负性调节T淋巴细胞，下调抗肿瘤免疫功能。说明CTLA-4基因多态性主要是通过A等位基因突变为G等位基因而减弱机体抗肿瘤作用，增加肝癌发生风险，而携带A等位基因则是降低肝癌患病风险的有利因素。CTLA-4基因上其他位点如启动子1722位点、启动子1661位点对肝癌易感性的影响，本研究未能全部纳入分析，为不足之处，有待后续补充报道。

综上，CTLA-4基因的外显子49位点基因多态性与肝癌易感性存在较大相关性，携带G等位基因的肝癌患病风险相对更大。