GC-MS/MS在研究生实验教学中的应用

虞俊超， 陈翠红， 徐利斯， 马小东， 孟凤林， 展思辉

(南开大学 环境科学与工程学院，天津 300351)

0 引 言

研究生实验教学是高校研究生培养的重要组成部分，是提高研究生科研水平和创新能力的中心环节[1-2]。在环境分析领域，熟练掌握相关仪器分析技术与方法对研究生进行科学研究及日后从事相关工作至关重要。虽然目前国内多数高等院校已开设了研究生的仪器分析实验教学课，但受实验条件限制，课程普遍与本科实验相近，实验教学内容拓展不足，这不利于研究生的高质量培养[3]。

气质联用仪因其兼有气相色谱的单一流动相(通常为He)供应优势、高效色谱分离能力及质谱对未知物的强大定性/定量功能而被广泛应用于热稳定性较好的中小分子化合物分析。由于其较宽广的使用范围，气质联用测试已成为化学、环境科学、环境工程等专业仪器分析课程的常见实验内容。国内关于气质联用实验的实践探索很多，但多是面向本科生且使用气相色谱-单级质谱联用仪(GC-MS)进行实验教学[4-8]。然而在实际的环境检测中，单级质谱(MS)常受到复杂环境样品的基质干扰，有时无法满足目标物的确证分析需求。相比于单级质谱，串联质谱(MS/MS)可对目标物进行二次裂解，有效地提高了测试的选择性和灵敏度，因此在环境分析中发挥着愈发重要的作用[9]。

近几年，在国家“统筹推进世界一流大学和一流学科建设”计划支持下，我校环境科学与工程学院陆续购置了一批高精尖仪器，集中于大型仪器平台共享使用，这对学院教学及科研发展形成了强有力的支撑。一流的研究生教育是高校实现“双一流”建设目标的基石[10]。为进一步提高研究生的科研实践能力，学院仪器平台依托其较优越的设备条件和专职教师丰富的分析测试经验，以必修课的形式开设了一系列的现代仪器分析课程(70学时)。本文涉及的“气相色谱-串联质谱联用(GC-MS/MS)测定土壤中的硝基苯”就是其中的一节实验课，课程紧系环境专业特色，并基于GC-MS/MS多样的定性/定量功能拓宽仪器分析实验内容，同时积极进行多元化教学方法实践，对研究生的气质联用实验教学进行探索。

1 GC-MS/MS实验教学选题情况简述

实验课面向研究生，考虑到他们将来科研工作中可能遇到更复杂多样的气质联用测试需求，因此选用GC-MS/MS进行实验教学。如图1所示，GC-MS/MS主要由5部分组成，分别为气相色谱、离子源、质量分析器、检测器及数据系统。进样后样品各组分先通过气相色谱进行高效分离，然后依次进入离子源完成离子化(形成带电离子)，质量分析器按离子质荷比(m/z)实现分离分析，检测器将样品中不同组分的存在情况转化为电信号，最后通过数据系统进行数据的汇总及处理。平台购置的气质联用设备采用大气压化学电离源(APCI)进行测试，因其优异的灵敏度和选择性，该软电离技术已被大量应用于GC-MS(/MS)分析测试中[11]。

图1 GC-MS/MS结构解析

与单四级杆质谱(MS)不同，三重四级杆串联质谱(MS/MS)由一级四级杆(MS1)，线性加速碰撞室及三级四级杆(MS2)3部分(见图1)构成。样品离子先进入MS1筛选出目标物的特征母离子；母离子与气体(Ar)碰撞，裂解产生子离子；再由MS2捕集子离子。GC-MS/MS的结构特性使其可提供更多分析模式：质谱全扫描模式(MS scan)和子离子扫描模式(Product ion scan)可分别用于样品组分的母离子和子离子电离特征分析，选择离子监测模式(SIM)和多反应监测模式(MRM)可分别选择目标物的特征母离子、母离子-子离子对进行定量分析。

硝基苯(Nitrobenzene)是一种芳烃类化合物，在农药、纺织、炸药等工业领域生产活动中应用广泛[12]。早在1989年，硝基苯就被国家环保局列入“水中优先控制污染物黑名单”。2016年，为切实加强土壤污染防治工作，国务院印发土壤污染防治行动计划，公布的污染物检测名单也包括硝基苯。土壤中硝基苯类污染物定量分析常选用气质联用仪(EI源)[13]，但目前尚无基于APCI源离子化的GC-MS(/MS)分析报道。依托学院大型仪器平台的设备条件，设计了GC-APCI-MS/MS测定土壤基质中硝基苯的实验教学课程，将科研项目转化为实验课程，丰富了实验的可探索性，有利于激发研究生的专业学习兴趣，培养科研创新思维。

2 实验教学目标的设定

(1) 通过教学，开拓学生的知识面，了解GC-MS/MS的结构与工作原理。

(2) 通过实验，掌握GC-MS(/MS)的主要操作方法，加深学生对气质联用仪开展环境分析测试的认识。

(3) 通过文献调研，让学生结合各自未来的研究方向，了解气质联用分析测试的适用范围，充分调动学生的主动学习兴趣，为将来的科研工作做准备。

3 实验准备与流程设计

3.1 试剂与材料

丙酮、正己烷、乙酸乙酯(色谱级)及无水硫酸钠(分析级)购自天津市化学试剂六厂。硝基苯标准储备液：1 g/L。弗罗里硅土SPE柱(500 mg/3 mL)购于东莞市谱标实验器材科技有限公司。无水硫酸钠使用前在马弗炉中300 ℃烘烤2 h，冷却后放入试剂瓶备用。

天亮后，先后有两个人扒着木排求救。男人没有再阻拦，任表姐把他们一个一个拉上木排。第二个上岸的人见表姐没穿衣服，身子抖得厉害，就脱下自己的衣服，拧干，让表姐穿上。那是件中山装，厚厚的卡其布料，外挂四个兜。应该是干部装，不知道是水里捞的还是那男人自己的。杨小水穿在身上又胖又长，连下身也罩得严严实实的。

3.2 仪器分析条件

Agilent 7890B-Waters Xevo TQS型气相色谱-串联质谱联用仪。

(1) 气相色谱条件。进样方式：不分流进样，进样量1 μL，进样口温度250 ℃，载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min。选用DB5-MS UI柱30 m×0.25 mm×0.25 μm，升温程序：起始温度40 ℃，保持4 min，以20 ℃/min升温至280 ℃，保持2 min。运行时间18 min，溶剂延迟为6 min，传输线温度280 ℃。

(2) 质谱条件。采用大气压气相色谱技术(APGC)，APCI电离源，正离子化模式，电晕针电压2.0 μA，离子源温度：150 ℃，MS scan扫描范围：20～300 m/z，Product ion scan 扫描范围：20～200 m/z。

3.3 土壤样品制备

样品前处理是完成待分析物提取、净化和富集的重要过程，对后续的分析测试效果影响显著[14]。考虑到土壤样品处理过程复杂，实验耗时过长，课程采用教学演示的方式对样品前处理各步骤用途、质量控制等方面进行详细讲解，具体制备流程如下：称取约10.0 g样品放入烧杯中，以20 mL丙酮-正己烷(1∶1, V/V)超声提取30 min，提取结束后使用离心机3 000 r/min离心5 min(提取流程重复3次)，合并有机提取液；提取液经无水硫酸钠柱除水后，使用弗罗里硅土柱净化样品：依次用10 mL正己烷、10 mL乙酸乙酯淋洗柱子，土壤提取液装载后，选用12 mL乙酸乙酯洗脱；将洗脱液氮吹至近干，使用正己烷定容至1 mL，待上机测试。

3.4 实验流程设计

实验流程如图2所示。以小组的形式(每组3～5人)开展实验教学，保证学生都能进行仪器操作。设计了两套实验方案，通过抽签分配仪器分析实验内容，引导不同组别的学生协作完成单级质谱的SIM和串联质谱MRM方法开发，并将两套方法对土壤基质样品的测试效果进行比较，让学生对GC-MS(/MS)的主要定性/定量功能有较全面的了解。

图2 GC-MS(/MS)实验流程设计

4 多元化教学方法探索

研究生是仪器分析实验教学过程中的学习主体，教师须改变以往“灌输式”的教学培养方式，增强教学的直观性、互动性、探索性，建立以学生为中心，教师为引导的新型教学关系[15-16]。为进一步提高实验教学效率，达到巩固研究生专业知识学习，提高科研创新能力的目标，课程从4个方面进行多元化的教学方法探索(见图3)。

图3 多元化的大型仪器分析教学方法实践

(1) 健全课前预习制度。强化学生课前预习。通过文献资料调研，让学生对硝基苯这类污染物的检测意义，仪器分析方法有所认识，以此锻炼学生的主动学习能力；开课前安排5 min，让学生重温实验讲义，使学生对教学内容与方式，实验准备流程、操作方法及相关注意事项有所了解，这有助于学生尽快进入课堂学习状态，提高学习效率。

(3) 开展基于问题的课堂回顾与讨论。要求学生在教学完成后积极提问，设置课堂回顾与讨论环节，并将此环节表现纳入成绩考核。通过课堂知识点回顾，深化学生对相关知识点的理解；提出问题本身就是一种更主动的学习过程，通过对问题的交流与讨论，可以有效强化同组学生对实验原理、方法的理解，也提高了学生们对仪器分析的探索兴趣和创造能力。

(4) 课后开放性问题拓展。针对本次实验教学内容，设置开放性问题，让学生结合自己的研究方向，进行相关资料的再检索。通过对实验现象进行开放性探索，有助于稳固学生知识积淀，提高实验教学效果。

5 实验结果与讨论

5.1 气相色谱条件选择

在课前文献调研的基础上[12]，让学生对气相色谱仪主要参数进行设置。进样口温度设定为250 ℃，确保硝基苯能以气态的形式进入色谱柱。实验选用DB5-MS UI非极性毛细管柱，设置梯度升温程序将硝基苯与样品杂质进行高效分离。选择正己烷作为溶剂，制备标样和土壤基质样品，在GC分析6 min后启动质谱，切除溶剂峰，减少溶剂对GC-MS/MS分析测试的干扰。通过标准品的总离子流色谱图确定硝基苯的保留时间为10.2 min。

5.2 质谱扫描条件优化

相比于单级质谱(MS)，串联质谱(MS/MS)可以提供更多样的扫描模式。在GC-MS/MS实验过程中，可以先使用质谱全扫描(MS Scan)了解硝基苯的APCI源电离行为，筛选出丰度较高的母离子，再采用子离子扫描模式(Product ion scan)观察特征母离子的裂解特征，结合两级质谱的扫描信息有助于推断待分析物的分子离子结构。锥孔电压、碰撞能量分别是MS Scan、Product ion scan模式中的重要调控参数，通过参数条件的梯度实验操作，使学生直接观察到参数值的更改对仪器响应的影响，既培养学生严谨的科研思维，也加深了他们对GC-MS/MS结构及测试原理的理解。硝基苯标准品的MS/MS扫描结果见图4，在APCI源离子化条件下，最优锥孔电压为25 V，全扫描谱图中最强峰是m/z 123.9，根据质荷比推断应该是硝基苯(C6H5NO2)的质子化离子[M+H]+，其余特征母离子主要为m/z 94.1、77.2及105.0。谱图里的m/z 148.7可能来源于气相系统中的酞酸酯类化合物干扰，该现象在其他气质联用测试中也有报道[17]。选择高丰度的母离子m/z 123.9，通过设置不同碰撞能量(10～30 eV)进行子离子扫描，记录产物离子m/z 77.0、93.8、51.0、66.1的最优碰撞能量参数。

通过质谱扫描条件优化，对硝基苯化合物建立了基于单级质谱的SIM定量方法，以及基于串联质谱的MRM定量方法，具体参数见表1。

5.3 土壤基质样品测试效果

采用外标法定量: 配制20、50、200、500、1 000 ng/mL硝基苯标准溶液，以目标化合物的浓度值为横坐标，峰面积为纵坐标，建立5点校准工作曲线。结果显示在0～1 000 ng/mL范围内测试线性效果良好，相关系数R2≥0.994 0。使用GC-MS/MS方法对土壤样品中的硝基苯含量进行测定，未有检出。通过对土壤基质加标样品(800 ng/mL)进行测定，全面比较SIM与MRM两种定量方法对真实环境样品的测试效果差别，不同方法的提取离子色谱分析效果如图5。分析结果表明，与SIM方法相比，串联质谱MRM方法选用母-子离子对进行分析测试，能明显降低土壤基质干扰，并增强色谱峰的信噪比值，显著提高仪器分析测试的灵敏度。通过比对实验，学生对GC-MS(/MS)的环境分析测试效果有了更直观的认识，这有益于他们日后科研工作的开展。

图4 硝基苯的质谱扫描条件优化

表1 基于MS(/MS)的硝基苯定量和定性离子选择

图5 GC-MS(/MS)对土壤加标样品的测定效果比对

6 结 语

为提高学生的分析操作、创新及团队协作能力，将大型仪器气相色谱-串联质谱联用仪引入到研究生的仪器分析实验课程中，选题为“GC-MS/MS测定土壤中的硝基苯”。课程紧系环境专业特色，并基于新设备多样的测试功能，设计两套气质联用定性/定量思路，引导学生协作式开展仪器分析实验，使学生对GC-MS(/MS)的主要分析测定功能有较全面的了解。同时为切实提高教学效果，从健全课前预习制度、贯彻对比性教学、开展基于问题的课堂回顾与讨论、课后开放性问题拓展4个方面进行多元化教学方法实践。该实验课开设已历时2年，对研究生科研实践能力的培养助力明显，教学效果良好。依托仪器平台的先进设备开展实验教学，课程本身也可看作是环境专业研究生的“公用仪器操作准入培训”，这为后续的公用实验室大型仪器开放，学生自主操作仪器开展科研工作奠定了坚实的基础。