基于丝肽功能化石墨烯增敏多巴胺电化学传感构建综合实验体系

王炎英, 屈 颖, 李春涯

(中南民族大学 a.实验教学与实验室管理中心;b.化学与材料科学学院，武汉 430074)

0 引 言

化学综合实验体系的完善不仅需强化学科之间的交叉渗透，更侧重科学前沿的引入，因此，新材料、新产品、新方法以及科研新进展都纷纷被改造为综合实验或创新性实验，从而开阔学生的视野，拓展知识领域[1-6]。

石墨烯是形成碳同素异形体(如石墨、碳纳米管、富勒烯等)的基本单元[7-8]，Geim等通过简单的实验获取了单层石墨烯[9]，这一开创性的工作使得石墨烯在物理、化学、生物以及材料科学等领域获得了广泛关注[7,10]。石墨烯具有一些独一无二的特性，如量子霍尔效应，室温下具有高量子迁移效率(～10 000 cm2/(V·s),大比表面积(2 630 m2/g)，好的光透性(～97.7%)，高弹性模量(～1 TPa)，优良的热传导性(3～5 kW/(m·K)和导电性，低热膨胀系数等。迄目前为止，基于无机纳米粒子、有机晶体、聚合物、有机金属框架化合物、生物材料、碳纳米管等的石墨烯复合材料都已成功制备，并广泛用于电池、 电容、 燃料电池、 光伏装置、 光催化、传感界面等领域[11]。本文以丝肽功能化石墨烯纳米复合材料(SP-Gr)构建出电化学传感界面，考察了其对多巴胺的传感性能，并实现多巴胺的高效检测，基于此衍生出新型综合创新实验体系，适用于材料化学、分析化学、应用化学等相关专业，囊括了材料制备及表征，电化学传感器制备方法，电化学表征及测试方法，电化学分析基本模式及数据处理等。主要内容如下：在碱性溶液中，高分子丝肽上的氨基会和氧化石墨烯表面的环氧基发生化学反应，从而实现氧化石墨烯表面修饰[12]，再经硼氢化钠溶液还原，可获得(SP-Gr)。采用透射电子显微镜、扫描电子显微镜、X-射线光电子能谱、X-射线衍射、紫外光谱等对所制备的(SP-Gr)进行表征。将SP-Gr分散至水相中，并滴涂至洁净的玻碳电极表面，蒸发溶剂后制备出SP-Gr膜修饰电极。考察多巴胺在该SP-Gr膜修饰电极上的电化学行为，发现在pH 7.0的磷酸缓冲溶液中，Gr-SP膜修饰电极对多巴胺表现出灵敏的响应性能，优化实验条件后，可实现多巴胺的高选择性、高灵敏度检测，并可成功用于注射液样品中多巴胺测定。

1 实验试剂及仪器

主要试剂：氧化石墨烯(先丰纳米)；高分子丝肽(MW=10 000～15 000)；多巴胺；硼氢化钠；Na2HPO4；NaH2PO4；KOH,所用试剂均为分析纯，溶液由超纯水配制。

主要仪器：CHI 660D电化学工作站(上海辰华仪器有限公司，上海)；透射电子显微镜(FEI Tecnai G220S-TWIN)；场扫描电子显微镜(JSM-6700F)；X-射线光电子能谱仪(Thermo Electron Corp., USA)；X-射线衍射仪(Bruker D8)；紫外-可见光谱仪；电子分析天平。

2 实 验

2.1 SP-Gr制备

SP-Gr制备方案如下：在20.0 mL超纯水中加入4 mg氧化石墨烯、20.0 mg丝肽和16 mg KOH，剧烈搅拌混匀，80 °C恒温 24 h。 向反应混合物中加入1.0 mol/L NaBH4溶液2.0 mL，维持80 °C恒温2 h。经高速离心分离，以超纯水洗去杂质及过量的高分子丝肽，减压干燥得SP-Gr纳米复合材料。

2.2 SP-Gr修饰电极制备及多巴胺测定

玻碳电极先用金相砂纸和氧化铝粉悬浊液抛光，超纯水洗净，然后依次用硝酸、乙醇和水超声清洗，在室温下晾干，备用。SP-Gr纳米材料用磷酸缓冲溶液超声分散成1.0 g/L溶液。用微量移液器移取5.0 μL SP-Gr溶液，滴涂至洁净的玻碳电极表面，室温晾干，即得SP-Gr膜修饰电极。

电化学测试在CHI 660D电化学工作站上进行，实验采用传统的三电极系统：玻碳电极(Ø=3.0 mm)或SP-Gr修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂柱电极为辅助电极。

SP-Gr修饰电极置于磷酸缓冲溶液中，在-0.2～0.6 V电位范围内循环伏安扫描至基线稳定。多巴胺盐酸盐以磷酸缓冲溶液配制成所需浓度，并移至10 mL电解池中，将SP-Gr修饰电极置于多巴胺溶液中，0 V电位下富集90 s,在-0.2～0.6 V电位区间内微分脉冲伏安法扫描，其氧化峰峰电流用于定量分析多巴胺。

3 结果与讨论

3.1 透射电子显微镜表征

由图1可知，3种纳米材料都呈现出分散的石墨烯片层结构，其直径在几百nm，表明石墨烯表面经丝肽修饰，不改变石墨烯的几何结构，可维持其大比表面积、高电子传导等特性，有利于构建性能优良的电化学传感器。

(a) 还原石墨烯

(b) SP-Gr纳米材料

(c) 材料的透射电镜图

3.2 X-射线光电子能谱表征

由图2可知，两种纳米材料中均含有C1s能级(284.6 eV)和O1s能级(531.8 eV)。在SP-Gr纳米复合材料的XPS曲线中存在N1s能级(399.6 eV)，而石墨烯的XPS谱图中未出现N1s能级，表明N元素主要来源于高分子丝肽，进而证实高分子丝肽成功修饰至石墨烯表面。

(a) 石墨烯

(b) SP-Gr纳米材料

图2 材料的XPS能谱曲线

3.3 X-射线衍射光谱表征

如图3所示，当2θ在5°～80°范围内变化时，氧化石墨烯分别在9.7°出现一个尖峰和23.2°出现一个扁平峰。而在石墨烯和SP-Gr中仅在23.2°观察到一个扁平峰。结果表明，高分子丝肽和氧化石墨烯键合后，可经NaBH4还原为SP-Gr纳米复合材料。

图3 材料的XRD谱图

3.4 UV/Vis光谱表征

如图4所示，以水为分散剂时，氧化石墨烯在225 nm处出现吸收峰，高分子丝肽在213 nm出现吸收峰。当丝肽修饰至石墨烯表面后，225 nm处的吸收峰红移至263 nm，表明结合高分子丝肽并经NaHB4还原后，石墨烯电子共轭体系得以修复。213 nm处的吸收峰蓝移至202 nm，源于石墨烯和丝肽的相互作用。氧化石墨烯和NaHB4反应后被还原为石墨烯，也可以由颜色变化获得证实。还原前，其水分散体系为棕色，而还原后转变为黑色。其浓度为1 g/L的分散液可维持数月不沉降，表明其在水相中具有很好的分散性，特别适合构建生物传感体系。

图4 材料的紫外可见光谱图

3.5 扫描电子显微镜表征修饰电极形貌

由图5可见，SP-Gr均匀覆盖至玻碳电极表面，呈现出褶皱状，石墨烯的纳米片层结构清晰可见。表明该纳米复合材料可稳定修饰至玻碳电极表面，并具有石墨烯的结构特性。

3.6 交流阻抗谱表征

由图6可知，Nyquist曲线相似，高频区为一圆弧，对应着扩散控制过程;而低频区为一条直线，对应着表面控制过程。 圆弧的半径可反映电极界面电荷传递电阻的大小，半径越大，电荷传递电阻越高。与曲线a相比，曲线b的圆弧半径大大增加，说明SP-Gr纳米复合材料阻碍了Fe(CN)63-/4-在电极上的电荷传递，作为丝肽载体的石墨烯是高导电材料，故其对探针电子传递的阻碍作用主要来源于丝肽分子，因为在该pH值条件下，丝肽分子带负电荷，与电活性探针之间存在静电排斥作用。

图5 SP-Gr纳米复合材料修饰玻碳电极的扫描电镜图

图6 5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]在SP-Gr修饰电极(a)和裸玻碳电极上的(b)Nyquist曲线(支持电解质为0.1 mmol/L KCl溶液)

3.7 多巴胺的循环伏安行为

采用循环伏安法考察50 μmol/L多巴胺在不同电极表面的电化学行为，结果如图7所示。由曲线b可知，在磷酸缓冲溶液中，当电位扫描区间控制在-0.2～0.6 V范围时，SP-Gr修饰电极无氧化峰、还原峰出现，表明其在该电位区间内为电化学惰性。在多巴胺溶液中，该修饰电极呈现出一对准可逆的氧化-还原峰，如曲线a所示，其氧化峰电位在0.22 V, 还原峰电位在0.16 V。在裸玻碳电极上，多巴胺也呈现出一对氧化-还原峰(曲线c)，氧化峰电位为0.20 V，还原峰电位为0.16 V，但氧化-还原峰峰电流明显小于其在SP-Gr修饰电极上的峰电流，表明丝肽功能化石墨烯纳米复合材料能增强多巴胺在电极表面的富集量，进而增强其检测灵敏度。

图7 50 μmol/L多巴胺在SP-Gr修饰电极(a)和裸玻碳电极(c)上的循环伏安曲线；曲线b是SP-Gr修饰电极在磷酸缓冲溶液中的伏安曲线

3.8 实验条件优化

3.8.1 pH值的影响

以SP-Gr修饰电极为工作电极，采用微分脉冲伏安法在pH 4.0～9.0范围内考察了缓冲溶液pH值对5.0 μmol/L多巴胺的电化学响应的影响。如图8所示，当磷酸盐缓冲溶液的pH值从4.0增加到7.0时，氧化峰峰电流逐渐增加；当pH值由7.0增至9.0时，氧化峰峰电流迅速减小，故选择pH 7.0的磷酸盐缓冲为支持电解质。

图8 电解质溶液pH值对5 μmol/L多巴胺在SP-Gr修饰电极上的氧化峰峰电流的影响

3.8.2 富集时间和富集电位的影响

如图9(a)所示, 当富集时间由0 s增加到90 s时, 多巴胺氧化峰峰电流随着富集时间的延长迅速增大。当富集时间超过90 s后，多巴胺氧化峰电流基本趋于平稳，表明丝肽功能化石墨烯对多巴胺的富集已基本趋于饱和，故选择在90 s条件做为最佳富集时间。同时在-0.20～0.40 V之间考察了富集电位对多巴胺氧化峰峰电流的影响，如图9(b)所示，在-0.20～0 V范围内，氧化峰峰电流随富集电位变化不大，当富集电位从0 V增加到0.40 V时，氧化峰峰电流随富集电位的增加而下降，主要是因富集电位接近其氧化电位所致，因此，选择在0 V作为最佳富集电位。

(a) 富集时间

(b) 富集电位

图9 5.0 μmol/L多巴胺在SP-Gr修饰电极上的氧化峰峰电流的影响

3.9 分析应用

在最佳条件下，以SP-Gr修饰电极为工作电极，采用微分脉冲溶出伏安法研究多巴胺氧化峰峰电流(Ipa)与其浓度(c)之间的关系，如图10所示。其氧化峰峰电流随多巴胺浓度增加而增大，在0.2～10 μmol/L呈线性关系，线性方程为

Ipa=0.317 2c+0.097 3(R=0.999)

检出限为56 nmol/L(S/N=3)。

采用加入回收实验法验证SP-Gr修饰电极测定多巴胺的准确性。测定10 μmol/L多巴胺的回收率在96.8%～101.6%，表明其具有较好的准确性。将该SP-Gr修饰电极用于多巴胺注射液样品分析，以考察其分析实际样品的能力。多巴胺注射液用磷酸缓冲溶液(pH7.0)稀释，采用标准加入法测得其多巴胺含量为(9.93±0.05) g/L(n=3,RSD=0.5%)，与注射液标示值10 g/L相吻合，表明该传感器具有实际应用价值。

图10 SP-Gr修饰电极用于多巴胺测定的校准曲线

4 结 语

该综合实验以高分子丝肽实现氧化石墨烯的功能化，经硼氢化钠还原为石墨烯，制备出丝肽功能化石墨烯，并修饰至玻碳电极表面构建电化学传感界面。基于石墨烯的大比表面积、高导电性，丝肽分子的生物亲和性，实现多巴胺在修饰电极表面的高效富集，从而获得高灵敏电化学传感系统，成功用于多巴胺电化学分析。实验体系涉及纳米复合材料的合成、表征，电化学传感界面的制备、表征，电化学分析实验条件优化及选择，电化学分析实验数据获取及处理，电化学传感器实际应用等方面，形成了序列性的科研创新模式，有助于培养学生综合实验技能、科研思维、创新意识及实际应用能力，也有利于激发学生的科研兴趣，为培养科研后备队伍奠定坚实基础。