促纤维增生性小圆细胞肿瘤靶向治疗的研究现状和展望

佘明金 综述 陈振东 审校

纤维增生性小圆细胞肿瘤（desmoplastic small round cell tumor，DSRCT）于1989年被首次报道，截至2015年，文献报道约850 例患者，发病主要在男性儿童和青少年，典型表现为多发性腹腔内肿瘤和独特的纤维增生间质［1］。该肿瘤缺乏特异性临床表现，常见症状包括腹痛、腹胀及腹部包块，伴随症状包括顽固性腹水、肝肿大等，确诊困难，大多数患者确诊时已发生转移［2］。由于初始化疗敏感，化疗是多数DSRCT患者的首选治疗方法。推荐使用治疗尤文氏肉瘤的化疗方案，其中P6 方案为长春新碱+多柔比星+环磷酰胺方案（VAC）和异环磷酰胺+依托泊苷（IE）交替方案［3］。DSRCT 的经典化疗方案。DSRCT预后差，多数患者中位生存期为17～25 个月［4］。为改变DSRCT 的治疗现状，迫切需要新的治疗方法。本文就DSRCT新的治疗靶点和治疗方向进行综述。

1 DSRCT的生物学特点

1.1 DSRCT的分子特性

DSRCT 是一种罕见的软组织肉瘤，t（11；22）（p13；q12）易位是DSRCT 稳定存在的遗传学特点［5］。确切的组织起源尚不清楚，迄今为止已鉴定出的药物靶点较少［6-7］。研究发现，90%以上的DSRCT患者存在特异性的染色体异位t（11；22）（p13；q12），使位于22q12 上的EWSR1 基因与位于11p13 上的WT1 基因融合。EWSR1-WT1 融合基因可经逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和荧光原位杂交（fluorescencein si⁃tuhybridization，FISH）检测，上述检测方法均具有较高的敏感性和特异性，对确诊DSRCT 具有重要意义［8］。在多数DSRCT 中，EWSR1-WT1 融合基因为EWS 的1～7 或1～8 外显子与WT1 基因的8～10 外显子融合。由于选择性剪接，导致融合蛋白存在不同的亚型，在锌指3 和4 之间插入和不插入3 个额外的氨基酸，如赖氨酸、苏氨酸和丝氨酸（KTS），从而发挥不同的生物学功能［9］。Ferreira 等［10］通过全外显子组测序对1 例DRSCT 患者体细胞和种系变异情况进行研究，结果确定导致蛋白质改变的遗传变异，包括12个体细胞和14个种系分子事件（其中11个为种系复合杂合子突变和3 个罕见的纯合子多态性），主要影响参与间充质细胞分化的基因。同时发现5 号和18 号染色体的扩增与11p、13q 和22q 染色体的丢失相关，11p和22q染色体的缺失也表明DRSCT存在典型的易位t（11；22）（p13；q12）。DSRCT 特异性分子标记物是EWSR1-WT1 融合蛋白。t（11；22）（p13；q12）染色体易位使EWS 的N-末端结构域和WT1C-末端的DNA结合域融合，导致异常转录因子的表达，目前认为EWSR1-WT1 融合蛋白的存在可能是DSRCT细胞增殖的本质所在。DSRCT至今尚无标准治疗方案，治疗策略主要为手术、放疗和大剂量化疗［11］。尽管临床上对DSRCT 进行了积极地治疗，但因易复发，迫切需要有针对性的靶向和免疫治疗。

1.2 DSRCT与尤文氏肉瘤

在认识到DSRCT 为一个独特的临床疾病之前，DSRCT通常被错误地分类为睾丸、卵巢、肠系膜或胃肠道的低分化非典型癌。尤文氏肉瘤（Ewings sarcoma，ES）也涉及EWS的基因融合，并且激活与EWS-WT1相似的致癌途径［12-13］。由于这种相似性，多数DSRCT患者接受ES的治疗方案如VAC方案和（或）IE方案作为一线化疗方案。由此可见，多数DSRCT的治疗策略和治疗方案是从ES治疗中衍生的［14］。然而，DSRCT患者的生存率明显低于ES患者，可见DSRCT与ES有着不同的生物学背景［15］。由于DSRCT临床较为罕见，DSRCT患者通常被纳入其他肉瘤患者的临床研究，而并非基于DSRCT 的特定分子特征进行临床研究。因此，确定DSRCT的特异性生物标记物和肿瘤相关的药物靶点至关重要，以通过靶向治疗改善DSRCT的不良预后［16］。

2 DSRCT的潜在治疗靶点

2.1 靶向EWRS1-WT1下游通路基因

野生型WT1 基因编码一种锌指蛋白，是一种转录抑制因子。在EWSR1-WT1融合基因中，WT1锌指区的缺失导致至少35个靶基因的转录激活［13］。激活的蛋白包括生长因子及其受体，如PDGFα、IGF1-R、EGFR、IL-2/15Rβ，转录调节因子（c-myc、n-myc、PAX2-2、WT-1 和ENT4），以及编码细胞外蛋白的基因（e-Syndecan-1、e-cadherin 和TALLA-1）。上述蛋白可能与肿瘤生长和治疗耐药相关，从而可能为DSRCT提供新的治疗靶点。然而尚未明确上述分子异常通过何种方式促进DSRCT 的发生发展，因此将其作为治疗靶点亟需进一步探索。胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF1-R）是一种酪氨酸激酶受体，研究表明IGF1-R 在DSRCT中广泛表达，与肿瘤的发生密切相关，其抑制剂可以通过IGF1-R、RAS/MAPK和JAK/STAT等多条通路抑制肿瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡［17］。Tap等［18］在一项Ⅱ期临床试验中应用抗IGF1-R 抗体ga⁃nitumab 治疗16例DSRCT 患者，结果显示1例部分缓解、10 例病情稳定（其中3 例疾病稳定时间超过24周）、4 例疾病进展，临床获益率为25%，中位无进展生存期（median progression-free survival，mPFS）为19个月。ganitumab主要不良反应为疲劳和恶心。

2.2 免疫相关治疗

细胞表面蛋白为免疫治疗提供了潜在的靶点。CD276 又称新抗原B7H3，在约96%DSRCT 细胞中表达。研究发现其对T细胞具有抑制作用，有助于肿瘤细胞免疫逃逸，在肿瘤生长和转移中发挥重要作用。Modak 等［19］研究发现，在DSRCT 患者中腹腔注射放射免疫结合物131I-8H9（8H9为以B7H3为靶点的小鼠单克隆抗体）具有良好的安全性。在使用131I-8H9进行治疗前，腹腔给予2 mCi124I-8H9示踪剂，以获取PET 图像和生物分布数据，结果提示腹腔注射131I-8H9 安全性良好，未见明显剂量限制性毒性。在一项Ⅰ期临床试验中，应用131I-8H9 治疗34 例DSRCT 患者，13 例患者的初步数据表明治疗耐受性好，对重要器官的辐射吸收剂量远低于正常范围，7例在减瘤术后接受治疗的患者中有6 例在治疗后11个月仍处于缓解状态［6］。基于上述研究结果，一项结合8H9 介导的放射免疫疗法和外照射放射治疗的Ⅱ期临床试验已于2016年开始，结果值得期待。

其他细胞表面蛋白主要被认为是免疫抑制剂的靶点，药物可以通过特异性的单抗与放射性核素交联形成偶联物。其中包括富含15-亮氨酸的重复膜蛋白（leucine-rich repeat-containing protein 15，LR⁃RC15），一种针对LRRC15 的抗体偶联药物ABBV-085 在多种实体瘤包括肉瘤的临床前实验中已显示出良好的疗效，其在肿瘤进展中的作用尚未明确［20］。脊髓灰质炎病毒受体（PVR，CD155）和PVR相关蛋白2（PVRL2，CD112）也是免疫治疗的潜在靶点，两者均为NK 细胞配体［13］，但由于表达水平差异较大，需要对患者进行详细的分层。靶向CTLA-4 和PD-1（CD279）的免疫检查点抑制被认为是治疗DSRCT 新策略。Burgess 等［21］分析了超过150个肉瘤亚型的肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrat⁃ing lymphocytes，TILs）中PD-1表达情况，结果发现高达65%肉瘤细胞表达PD-L1，同时伴有PD-1 TILs 阳性，并且与较差的总生存率和肿瘤的侵袭性相关，但在DSRCT病例中并无上述情况。

2.3 抗血管生成治疗

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）依赖性血管生成在DSRCT发生、发展中发挥重要作用。Bétrian 等［22］评估了9 例进展期DSRCT患者抗血管生成治疗的疗效，其中6例接受舒尼替尼、2 例接受索拉非尼、1 例接受贝伐珠单抗，平均无进展生存期（progressive-free survival，PFS）分别为3.1、3.8、2.0个月，研究发现尽管疗效有限，但经过多线治疗后，应用靶向治疗能够改变治疗决策从而提高疗效。Shi 等［23］应用阿帕替尼（500 mg/d）治疗1例DSRCT，治疗2 个月后发现肿块退缩明显，腹水减少，肿瘤标记物降至正常。George等［24］应用舒尼替尼治疗1例DSRCT，获得疾病稳定达56周，该研究建议有必要进一步评估舒尼替尼在DSRCT等非胃肠间质瘤亚型中的疗效。Menegaz 等［15］应用帕唑帕尼单药治疗29 例DSRCT，发现疾病稳定者占55%，1 例部分缓解（3%），1 例完全缓解（3%），11 例疾病进展（38%）。mPFS 为5.63 个月（95%CI：3.23～7.47），中位总生存期为15.7个月（95%CI：10.3～32.4），提示帕唑帕尼具有良好的耐受性，为晚期DSRCT 患者提供了新的治疗选择。申锋等［25］报道应用瑞戈非尼治疗1例DSRCT，至研究截止时PFS已延长15个月。

安罗替尼作为一种多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，可抑制血管内皮生长因子受体（vascular endothe⁃lial growth factor receptor，VEGFR）、成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）、血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth fac⁃tor，PDGFR）、c-Kit 和Met。Chen 等［26］应用安罗替尼治疗1例复发难治性腹部DSRCT，在治疗4个周期后淋巴结显著减小，截至研究发表时PFS 接近4 个月，患者继续使用安罗替尼作为维持治疗，情况良好。安罗替尼的不良反应主要为高甘油三酯和疲劳，但是可控且可耐受的。安罗替尼为腹部转移性DSRCT的治疗提供了新的选择。

2.4 DNA损伤修复途径

近期的突变分析［27］揭示了DSRCT 中与免疫反应、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transi⁃tion，EMT）和DNA 损伤反应（DNA damage response，DDR）相关的基因表达下调。6个DSRCT样本的全外显子组测序共鉴定出137个独特的体细胞突变，其中133 个突变基因是病例特异性的，2 个基因在不同病例中发生了不同位置的突变。上述研究结果突出了DSRCT 基因组的异质性（除融合基因外）。在135 个突变基因中，其中27%与EMT/间充质上皮逆转（mes⁃enchymal-epithelial reverse transition，MErT）以 及DNA 损伤修复（DNA damage response，DDR）通路有关。这些蛋白质包括在细胞周期中具有关键功能的蛋白质，如共济失调毛细血管扩张和Rad3 相关蛋白（ataxia telangiectasia and Rad3-related protein，ATR）和核糖核苷二磷酸还原酶亚基M2（ribonucleoside-di⁃phosphate reductase subunit M2，RRM2）。Mellado-La⁃garde 等［28］证明了在患者来源的异种移植模型中DSRCT 对PARP 抑制剂联合治疗的有效性。这一策略也被证明在ES 中有效，PARP 抑制剂与标准治疗（伊立替康和替莫唑胺）联合治疗的完全缓解率>80%，而标准治疗组死亡率为100%。可能原因为在ES和DSRCT中，EWS融合基因对野生型EWS的干扰可导致复制应激和DDR系统缺陷。van Erp等［29］发现PARP1和SLFN11在DSRCT临床前模型中高表达，并且在奥拉帕尼和替莫唑胺（temozolomide，TMZ）联合治疗后肿瘤退缩。结果研究表明奥拉帕尼和TMZ联合治疗可能是DSRCT的一种潜在治疗选择。

2.5 PI3K/Akt/mTOR信号通路

Subbiah 等［30］对DSRCT 进行了形态蛋白组学分析，结果提示DSRCT 细胞存在P13K/Akt/mTOR 信号通路持续活化。Tirado 等［31］研究发现，mTOR 抑制剂雷帕霉素可以在体外诱导JN-DSRCT-1 细胞（EWSWT1 基因融合DSRCT 模型）凋亡。通过增加雷帕霉素的浓度，可以继续上调促凋亡蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白Bcl-xL，从而诱导细胞凋亡。该研究还发现［31］，雷帕霉素阻止mTOR 激酶靶点的磷酸化，从而下调EWS/WT1 融合蛋白的表达。Thijs 等［32］通过每周静脉注射25 mg的mTOR抑制剂temsirolimus治疗1例转移性DSRCT 患者，结果发现患者生存质量显著改善，PFS达40周。Naing等［33］应用temsirolimus联合IGF-1R单抗cixutumumab治疗3例DSRCT患者，其中2 例疾病稳定的持续时间超过5 个月，提示该治疗方案对于DSRCT治疗初步有效且不良反应可耐受。

2.6 其他靶向位点

Fine等［34］报道，应用雄激素阻断疗法治疗雄激素受体（androgen receptor，AR）表达阳性的DSRCT，6 例患者中3例临床治疗反应良好，特别是在基线睾酮水平正常的患者中。Xiu 等［35］运用分子探针对35 例DSRCT 患者进行检测，并与ES 进行比较，结果发现AR表达明显提高（59%vs.3%）。

神经节苷脂2（ganglioside 2，GD2）是一种在包括DSRCT在内的多种实体瘤中表达的鞘糖脂。其功能尚未明确，但被认为在肿瘤细胞黏附到细胞外基质蛋白过程中发挥重要作用。GD2被用作为黑色素瘤、神经母细胞瘤和骨肉瘤的免疫治疗和放射免疫治疗靶点，然而，在一项20例DSRCT样本研究中仅2例呈GD2 阳性。GD3 是GD2 生物合成上游的神经节苷脂，在分析的20 例样品中有14 例表达GD3。GD3 与黑色素瘤细胞的增殖、黏附和侵袭性有关，可能成为DSRCT靶向治疗研究的方向［36］。

结缔组织生长因子（connective tissue growth fac⁃tor，CCN2）的表达水平在DSRCT中明显提高，与大量细胞外基质的产生相关，提示CCN2可能参与肿瘤细胞生长、基质形成和血管生成的自分泌和旁分泌调节，CCN2可能成为DSRCT新的治疗靶点［37］。

3 结语

目前，多项靶向治疗DSRCT 的研究均为个案报道或小样本研究，安全性和有效性亟需进一步证实。许多靶向化合物近期已被纳入DSRCT的临床试验，但多数治疗方案是从其他类型的肿瘤中演变而来，有限的患者例数对临床试验的开展构成挑战。

目前，对于驱动DSRCT 的潜在分子机制知之甚少，尚需更多的基础研究为临床治疗建立坚实的理论基础。为了支持基础研究的开展，同样需要开发更多的模型来更好地描述肿瘤的异质性和肿瘤与基质细胞之间相互作用的复杂性。由于异种移植物难以在体外培养，到目前为止仅已建立一个DSRCT 细胞系。靶向丰富的间质干细胞可能具有重要意义，特别是在其他类型肿瘤中已成功应用的基础上。此外，使用液体活检特别是循环肿瘤DNA（包括肿瘤特异性EWRS1-WT1 融合基因）检测肿瘤微小残留、疾病复发以及评估疗效可能具有临床意义［38］。利用EWRS1-WT1 融合基因特异性基因组断裂点可以设计一种个性化的生物标记物，用于患者随访期间评估血浆中的循环肿瘤DNA，该生物标记物有望成为DSRCT诊断、治疗和预后判断的标志物［10］。

综上所述，根据目前在DSRCT中的分子机制研究，有希望的治疗靶点主要与免疫应答、DDR网络或上皮-间质转化/间质-上皮转化有关。DSRCT肿瘤异质性高，确诊时多数处于晚期，反复治疗后易产生耐药性，联合治疗可以显著改善治疗效果。化疗与靶向或免疫治疗联合应用，将可能是未来的治疗方向。